青蒿琥酯诱导hl60细胞凋亡的研究论文

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1、青蒿琥酯诱导HL60细胞凋亡的研究论文刘俊玲，虞荣喜，陈均法【摘要】本研究旨在研究青蒿琥酯体外诱导HL60细胞凋亡及其过程中Bcl2与ICAD蛋白表达的变化。采用MTT法测定青蒿琥酯对HL60细胞的生长抑制作用；用光学显微镜检、琼脂糖凝胶电泳、流式细胞术观察和检测青蒿琥酯诱导HL60细胞的凋亡；应用蛋白印迹法检测青蒿琥酯诱导HL60细胞凋亡过程中Bcl2与ICAD的表达变化情况。结果表明：青蒿琥酯对HL60细胞有明显的生长抑制作用，并呈时间、剂量依赖性。48小时IC50值为18.33μg/ml，其

2、增殖抑制作用与诱导细胞凋亡有关；Bcl2和ICAD在HL60细胞中均有表达，且随药物浓度的增高表达量逐渐降低。结论：青蒿琥酯可诱导HL60细胞凋亡，Bcl2和ICAD在青蒿琥酯诱导HL60细胞凋亡的信号传导途径中可能是重要的调控因子。【关键词】青蒿琥酯HL60细胞系细胞凋亡ApoptosisofHL60CellsInducedbyArtesunateInVitroAbstractThestudyedtoinvestigatetheeffectofartesunate(ART)ontheapoptos

3、isofHL60cellsinvitroandtheexpressionofBcl2andICADintheprocessofapoptosisinducedbyART.TheinhibitionofARTonHL60cellseansofMTTassay;cellapoptosisicroscopy,agarosegelelectrophoresis,floetry;I1640配制所需浓度；碘化丙啶（PI）、噻唑蓝（MTT）为Sigma公司产品；细胞凋亡DNALadder提取试剂盒购自北京博大泰克生物基

4、因技术有限公司；bcl2和ICAD单克隆抗体均为美国SantaCruz公司产品。细胞系及细胞培养急性早幼粒细胞白血病细胞株HL60由浙江大学医学院附属第二医院肿瘤研究所提供。细胞按常规悬浮细胞培养法培养于含10%热灭活小牛血清的RPMI1640培养液中，置37℃、5%CO2培养箱中培养。每2-3天传代1次，取对数生长期细胞进行实验。MTT测定取对数生长期细胞，调整细胞浓度至1×105/ml，接种于96孔板，每孔100μl，青蒿琥酯终浓度分别为1、2、4、8、16、32、64及128μg/ml，每孔100μl，

5、设空白对照组。药物分别作用24、48、72小时后，每孔加MTT20μl，于37℃、5%CO2培养箱中培养4小时，离心弃去上清液，每孔加入DMSO150μl，振荡摇匀，在570nm酶标仪上测吸光度值（A570），计算抑制率，求半数抑制浓度IC50。细胞抑制率（%）=（A对照－A实验/A对照）×100%细胞经对照组、给药组作用48小时后，收集细胞，经磷酸盐缓冲液（PBS，pH7.4）洗2遍后，细胞制片机离心、制片，ulticycle2.50DNA分析软件处理。Bcl2和ICAD表达的orphologicalchan

6、gesofHL60cellsinducedbyARTunderlightmicroscope.A:cellsinducedbyARTat16μg/mlfor48hours.B:control(:marker.Lane1:controlgroup.Lane2:8μg/mlgroup.Lane3:16μg/mlgroup.Lane4:32μg/mlgroup.细胞凋亡的流式细胞术检测DNA的PI染色结果显示：青蒿琥酯作用于HL60细胞48小时后出现亚二倍体峰（即细胞凋亡峰），且亚二倍体峰所占比例随青蒿琥酯浓度的增

7、加而增加。空白对照组及8、16和32μg/ml浓度实验组的细胞凋亡率分别为6.40%、23.64%、54.45%和77.53%（图3）。Bcl2和ICAD蛋白的表达Bcl2和ICAD在HL60细胞中均有表达，并且表达量较高。青蒿琥酯作用于细胞48小时后，随着药物浓度的增大，Bcl2和ICAD两种蛋白的表达量逐渐降低（图4）。讨论细胞凋亡是生物体内广泛存在的一种由细胞特定基因控制的细胞主动死亡过程，这一过程不仅存在于正常组织与器官，也存在于各种肿瘤组织，与肿瘤的发生、转归及抗肿瘤药物的治疗有密切关系。细胞凋

8、亡的检测包括形态学、生物化学、免疫化学、组织化学和分子生物学等方面。我们对青蒿琥酯诱导HL60细胞凋亡进行了形态学、凋亡的定性定量、凋亡机制方面的研究。通过DNA电泳及流式细胞术检测，结果提示青蒿琥酯是通过诱导HL60细胞凋亡而抑制其生长的。bcl2基因是血液系统恶性肿瘤中最为重要的拮抗凋亡的基因，主要位于核膜、粗面内质网和线粒体膜上［3］。bcl2可能通过抑制C