青蒿琥酯诱导人胚肺成纤维细胞凋亡的分子机制研究论文

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1、青蒿琥酯诱导人胚肺成纤维细胞凋亡的分子机制研究论文王昌明，张孝飞，黄岚珍，范才文，林云，徐青【摘要】目的研究青蒿琥酯对人胚肺成纤维细胞(HELF)系HFL-I细胞株体外生长的影响，为青蒿琥酯抗纤维化提供实验依据。方法采用CCK-8法检测青蒿琥酯对体外培养的HFL-I细胞的生长抑制作用，用流式细胞术测定细胞凋亡率;RT-PCR法测定Bcl-2mRNA和BaxmRNA表达。结果青蒿琥酯呈浓度依赖性抑制HFL-I细胞增殖.freelRNA的表达显著低于对照组，BaxmRNA的表达显著高于对照组。结论青蒿琥酯具有抗肺纤维化作用，可能机制为通过下调Bcl-2mRNA和上调BaxmRNA表达抑

2、制HFL-I细胞增殖，促进HFL-I细胞凋亡。【关键词】青蒿琥酯;人胚肺成纤维细胞;增殖;凋亡;Bax;Bcl-2肺纤维化是多种病因引起的一种慢性炎性间质性肺疾病，患者平均生存时间一般不超过3年，目前尚无有效治疗方法。近年研究发现，青蒿素类药物除可抗疟疾外，亦具有抗肿瘤、抗感染及抗纤维化等作用。2009-06～2009-11，我们观察了青蒿素衍生物青蒿琥酯对人胚肺成纤维细胞(Humanembryoniclungfibroblast，HELF)系HFL-I细胞增殖、凋亡的影响及机制，旨在为临床治疗肺纤维化提供理论依据。1材料HFL-I细胞株(中国科学院细胞库提供)，青蒿琥酯(分析纯，

3、纯度99%，广西桂林南药公司产品，批号ZA080203)，CCK-8试剂，二甲基亚砜(DMSO)，碘化丙啶(PI)，D-MEM/F-12培养基，FBS，胰酶;RNA提取试剂Trizol，反转录试剂盒PrimeScriptTMRTreagentKit，PCR试剂盒PremixPrimeSTARHS，引物由上海生物工程有限公司合成。2方法2.1HFL-I细胞培养取HFL-I细胞株，用含10%FBS、1×105U/L青霉素及100mg/L链霉素的D-MEM/F-12培养液培养，37℃、5%CO2培养箱培养，3d换液1次，5～6d传代1次。取4代以上细胞用于下列实验。2.2细胞增殖及细胞增

4、殖抑制实验采用CCK-8法。取对数生长期HFL-I细胞接种于96孔培养板中，每孔10000个，12h后分别加入浓度分别为2.5，5，10，20，40，80mg/L的青蒿琥酯，对照组加入等体积培养液，每组设3个复孔，37℃、5%CO2饱和湿度下培养48h，期间吸去培养液，PBS洗涤1次，加入含10%CCK-8溶液100μl的无血清培养基，继续培养2h后于450nm处测定吸光度(A值)，并计算各组细胞抑制率。细胞抑制率(%)计算公式：(1-实验组A值/对照组A值)×100%。2.3细胞凋亡形态学观察HFL-I细胞调整浓度为1×106/ml种于6cm皿中，待细胞完全贴壁后，经10mg/L

5、青蒿琥酯作用48h，进行Hochst33258染色，于荧光纤维镜下观察并摄像。2.4流式细胞数术检测细胞凋亡率取对数生长期HFL-I细胞，用含10%FBS的D-MEM/F-12培养液调整细胞浓度为1×106/ml，接种于25cm2的培养瓶中，5%CO2、37℃培养箱中培养12h至贴壁，用含0.5%FBS的D-MEM/F-12培养液培养24h，使细胞周期同步化。加入浓度分别为1，10，100mg/L的青蒿琥酯，对照组加入等体积培养液，每组设3个复孔，作用48h后收集贴壁细胞，制成单细胞悬液，70%乙醇固定，4℃保存过夜，-20℃保存(有效期为1周)。检测前用PBS洗去固定液，加入20

6、μlRnaseA，37℃孵育30min，暗处加PI染液，冰浴30min，染色后以300目筛网过滤。调整细胞浓度为1×105～6/ml后采用流式细胞仪，在波长488nm下用MulticycleDNA分析软件行凋亡率测定，实验重复3次。2.5RT-PCR检测Bcl-2mRNA和BaxmRNA的表达HFL-I细胞种于6孔板，细胞贴壁并长至80%丰度，换含2%血清培养基(D-MEM/F-12)培养12h，后加入不同浓度的青蒿琥酯(1，10，100mg/L)，设不加药物的阴性对照组，继续培养24h后，用Trizol试剂提取高质量的mRNA。按照反转录试剂盒说明合成cDNA。PCR引物序列如下

7、：人内参β-actin：上游引物5'-AAGATCCTGACCGAGCGTGG-3'，下游引物：5'-CAGCACTGTGTTGGCATAGAGG-3'，扩增长度300bp，Bax上游引物：5'-ATTGGAGATGAACTGGACAA-3'，下游引物：5'-CCACAAAGATGGTCACTGTC-3'，扩增长度454bp，Bcl-2上游引物：5'-CAGCTGCACCTGACGCCCTT-3'，下游5'-GCCTCCGTTATCCTGGATCC-3'，扩增长度19