青蒿琥酯诱导肺腺癌细胞凋亡的机制研究

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1、硕士学位论文题目：青篙琥酯诱导肺腺癌细胞凋亡机制的研究学位申请人：专业名称：研究方向：‘所在院系：导师姓名及职称：论文提交日期：潘文良生物物理掌抗癌药物机理研究生物光子学研究院‘陈同生教授二零一零年六月dyontheMechanismofArtesunate—-InducedLungAdenocarcinomaCellsApoptosisByWenliangPanSupervisorProfessorTongshengChenAtCollegeofBiophotonics，SouthChinaNormalUniversityJune，20

2、10摘要lIIIIIIIIIIIIllllllY1768444细胞凋亡是一种高度有序的程序性死亡的方式，它主要通过两条途径来启动：死亡受体途径和线粒体介导的途径。这两条途径都会活化下游的死亡执行者caspase．3，因此如何更好地监测活细胞内caSpa∞．3的活性成为了一个关注点。近年来，天然的植物提取药，特别是传统中药的药用植物的潜力已经得到广泛承认。虽然前人付出了很多努力研究青蒿琥酯的抗肿瘤机制，但是青蒿琥酯对人肺腺癌细胞的作用机制仍然不清楚。本文第一章绪论部分总结了凋亡信号转导通路的研究现状，概述了青蒿琥酯诱导凋亡的机制，荧光能量共

3、振转移(FⅪ’T)与荧光寿命成像(FLIM)的基本原理及其应用，同时说明了本课题研究的目的和意义。本文的实验工作主要分为两个部分：在第一部分的实验工作中，本文利用双光子激发的荧光寿命成像和荧光光谱成像这两种方法在抗癌药物诱导的人类肺腺癌(ASTC．a-1)细胞死亡的过程中分析单个活细胞内caSpa∞．3的活化。SCAT3是基于荧光能量共振转移(FRET)技术构建的caspase．3的探针，在稳定表达SCAT3的活细胞内对其进行双光子发射光谱成像。通过测量发射光谱的两个峰的比值(526nm／476rim)得到78011111波长可以选择性地

4、激发SCAT3供体中的ECFP。采用星孢菌素和蟾蜍灵处理细胞后，与对照细胞相比，526nlil谱峰明显下降，476am谱峰明显上升，而经过紫杉醇处理后，SCAT3荧光光谱没有明显的变化，表明星孢菌素和蟾蜍灵诱导了细胞内caspase．3的活化，而紫杉醇并没有活化caspase．3。然后，运用荧光寿命成像的方法测量活细胞内ECFP的荧光寿命。经过紫杉醇处理后供体ECFP的荧光寿命与对照组一致，都为1．83±0．02ns，而经过星孢菌素和蟾蜍灵处理后分别显著性地上升到2．05±O．03ns和1．90±O．0311S，SCAT3的FRET效率也

5、由对照组的24．38％分别下降到15．29％和21．49％，表明细胞内的SCAT3被切割释放了ECFP，进一步证明了星孢菌素和蟾蜍灵细胞内caspase．3的活化，而紫杉醇则没有。同时，双光子激发的荧光寿命和荧光光谱成像也被证明是两种检测活细胞内caspase．3活化的可行的方法。在第二部分的实验工作中，我们第一次证明在青蒿琥酯诱导的ROS介导的肺腺癌细胞凋亡过程中，青蒿琥酯诱导了Smac，AIF从线粒体中的释放，而cytochromeC和caspase一9并没有参与此过程。CCK．8和流式细胞仪的实验的结果显示抗氧化剂NAC能够减弱青蒿

6、琥酯诱导的细胞死亡和磷脂酰丝氨酸的外摘要翻，证明了青蒿琥酯诱导了ROS介导的细胞凋亡。基于FRET的质粒FRET-Bid，SCAT9和SCAT3，在青蒿琥酯诱导的细胞凋亡过程中，我们检测了活细胞内caspase．8，caspase．9和caspase．3的活性，证明了青蒿琥酯诱导了caspase．8和一easpase．3的活化，但并没有活化caspase．9。本文进一步运用荧光底物和westernblotting的方法加以验证了这些结果。共聚焦成像和westemblotting的结果显示青蒿琥酯诱导了Bax的转位和ROS介导的Smac和A

7、IF，但不是cytochromec的释放。同时，运用流式细胞仪检测Rhodaminel23荧光的强度，也发现青蒿琥酯诱导了ROS介导的线粒体膜电位的下降。关键词：细胞凋亡，青蒿琥酯，caspase．3，荧光共振能量转移技术，荧光寿命和荧光光谱成像，llABSTRACTApoptosis，oneoftheprogrammed．celldemh(PCD)，isahighlyorderedformofcellsuicide．Thebiochemicalapoptosisisactivatedviatwowell-establishedpmhwa

8、ys：deathreceptor-mediatedpathwayandmitochondria-mediatedpathway．Bothofthesepathwaysconvergeonthe