尼莫地平对阿糖胞苷诱导hl60细胞凋亡机制影响的研究

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1、尼莫地平对阿糖胞苷诱导HL60细胞凋亡机制影响的研究【摘要】为了研究尼莫地平对阿糖胞苷诱导HL60细胞凋亡机制的影响，采用琼脂糖凝胶电泳检测其DNA凋亡带，用细胞免疫组织化学方法检测细胞凋亡相关基因bcl2、bax的蛋白表达。结果表明，实验组自培养8小时起琼脂糖凝胶电泳显示典型的DNA梯形凋亡带。Bcl2蛋白表达在各实验组随培养时间延长逐渐下降，而Bax蛋白的表达则逐渐增加，Bcl2/Bax比值逐渐下降，8小时就与对照组出现差异（P<0.05）。结论：尼莫地平及阿糖胞苷均能促进HL60细胞凋亡，诱导其

2、凋亡的机制与下调bcl2及上调bax基因的蛋白表达有关。尼莫地平能加强阿糖胞苷促进HL60细胞凋亡，其机制与协同下调bcl2的表达有关。【关键词】尼莫地平阿糖胞苷凋亡HL60细胞系蛋白表达Bcl2BaxEffectofNimodipineonMechanismsofHL60CellApoptosisInducedbyCytarabineAbstractTheaimechanismsofHL60cellapoptosisinducedbynimodipine(NMDP)andcytarabine(AraC

3、).TheDNAfragmentmunohistochemistry.Theresultsshoentalgroupsparedentalgroupsthanthatinthecontrolgroup,entalgroupsthanthatinthecontrolgroup.ItisconcludedthatNMDPandAraCinduceapoptosisofHL60cells,andthemechanismofapoptosisinducedbythemmaydoechanismofHL60cellapop

4、tosisinducedbyAraCandNMDPisprobablyassociatedodipine;cytarabine;apoptosis;HL60cellline;proteinexpression;Bcl2;Bax白血病多药耐药性(MDR)的产生是导致化疗失败的一个主要原因［1],凋亡相关基因bcl2、bax的表达与白血病耐药之间有着密切关系［2]。bcl2表达增高能使白血病细胞抵抗糖皮质激素、VP16、DNR、MIT、AraC、VCR、ADM和ATRA等化疗药物及X射线所诱导的凋亡，bax是调

5、节bcl2肿瘤耐药的重要基因之一［3］。研究表明，钙通道拮抗剂尼莫地平(nimodipine,NMDP)通过加强化疗药物诱导细胞凋亡而达到化疗增强作用［4、5］。NMDP是如何加强化疗药物诱导细胞凋亡的？其作用机制尚不明了。为此，本研究以人类早幼粒细胞白血病细胞株（HL60）为研究对象，探讨尼莫地平对阿糖胞苷诱导HL60细胞凋亡机制的影响，为临床合理用药提供理论依据。材料和方法细胞和主要试剂HL60细胞株引自武汉大学典型培养物保藏中心。NMDP购来自德国拜尔公司，AraC购自上海华联制药厂。RabbitAnt

6、iBcl2、RabbitAntiBax、SABC试剂盒、DAB显色试剂盒均购自武汉Boster公司。基因组DNA抽提试剂盒购自上海生物工程有限公司，DNA电泳marker购自TaKaRa公司。细胞培养和分组HL60细胞在含有10%新生牛血清的RPMI1640培养液中悬浮培养。每2-3天传代1次。实验前调整细胞浓度为5×105/ml。实验时将对数期生长细胞分为4组。A组：对照组（HL60组）；B组：HL60+NMDP（0.01mg/ml）组；C组：HL60+Arac(0.05mg/ml)组；D组：HL6

7、0+NMDP+Arac组。细胞分别培养0、8、16、24小时。DNA琼脂糖凝胶电泳观察DNA梯形条带。取不同培养时间的HL60细胞各1.5×106个，按照DNA抽提试剂盒的说明提取DNA，用冷乙醇洗涤2次，最后在2.5%的琼脂糖凝胶块上于4V/cm条件下，电泳1小时，紫外灯下观察DNA电泳条带。凋亡调节基因检测Bcl2蛋白表达取不同培养时间的HL60细胞各1×106个，离心，涂片，干燥，丙酮固定30分钟。浸泡于1份30%H2O2和50份甲醇的混合液中30分钟，然后加入pH7.8的0.1%胰酶液中37℃消化10分

8、钟，用PBS洗3次后按照试剂盒说明逐步进行操作，其中阴性对照组不加一抗，改加PBS。最后在DAB试剂显色后，脱水、透明、封片、照相。图象扫描测定积分光密度值。Bax蛋白表达实验方法与Bcl2蛋白表达的测定相似。统计学处理所有数据均用±SD表示，采用SPSS10.0统计软件进行方差分析。结果DNA琼脂糖凝胶电泳B、C、D组细胞于8