survivinshrna促进hl―60细胞凋亡及其对阿糖胞苷敏感性的研究

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1、SurvivinshRNA促进HL—60细胞凋亡及其对阿糖胞苷敏感性的研究［摘要］目的研究RNA干扰Survivin基因表达对HL-60细胞凋亡及其对阿糖胞苷敏感性的影响。方法采用PCR扩增以及定向克隆技术重组构建shRNA的表迗载体pshRNA-Survivin’使用脂质体介导转染至HL-60细胞，分为6组：①空白实验组；②阿糖胞苷（Ara-C）组；③阳性质粒组；④阴性质粒组；⑤阳性质粒+Ara-C组；⑥阴性质粒+Ara-C组。采用RT-PCR技术检测HL-60细胞内Survivin及其mRNA表迗，运用流式细胞仪进行

2、细胞凋亡率改变的检测。结果与空白实验组比较，阳性质粒组的mRNA表达抑制率为57.7%,表迗下降，差异有统计学意义（P1.2.3细胞培养与转染胎牛血清（FBS）占20%体积的IMBM培养基，于37°C、5%C02、相对湿度为90%的培养箱中进行无菌细胞培养，培养细胞为悬浮生长。待细胞进入指数对数期铺6孔板，24h后用FBS洗涤细胞两次并更换为无FBS的IMBM培养基，室温下10uLLipofectamine2000与240uLIMBM轻轻混匀，孵育5min，取5uL质粒与245pLIMBM轻轻混匀，孵育5min，将二者轻

3、轻混匀，室温下孵育20min，逐滴滴入6孔板，并轻轻晃动细胞板。6h后更换为有血清的培养基，48h后检测结果。1.2.4实验分组实验分6组，①空白实验组：FBS占20%体积的IMBM培养基，于37°C、5%CO2、相对湿度为90%的培养箱培养的处于对数期的细胞，约106个。②Ara-C组:取对数期细胞，约106个，加用阿糖胞苷，浓度约为5Pg/uL,相当于临床上一次用药量的1/250［7］。③阳性质粒组：按照上述转染步骤加入5uL阳性质粒。④阴性质粒组：按照上述转染步骤加入5PL阴性质粒。⑤阳性质粒+Ara-C组：按照上

4、述转染步骤加入5uL阳性质粒，48h后加入5yg/nL的Ara-C，作用24h观察结果［8］。⑥阴性质粒+Ara-C组：按照上述转染步骤加入5uL阴性质粒，48h后加入511g/11L的Ara-C，作用24h观察结果。1.3观察指标1.3.1RT-PCR对SurvivinmRNA表迗的检测运用Trizol提取细胞的总RNA，随后紫外分光光度计进行定量。采用逆转录试剂盒将RNA转录成cDNAoRT-PCR将细胞的cDNA作为模板，扩增Survivin、0-actin基因。利用GeneFisher软件设计引物，Survivi

5、n正义链5’-TTGGCAGGTGCCTGTTGAAT-3’，反义链5’-AGCCAGTCCCCCACAGCAT-3’，目的基因465bp。3-actin正义链：5’-GACAACGGCTCCGGCATGTG-3’，反义链：5’-TGAGGATGCCTCTCTTGCTC-3’，目的基因166bp。PCR反应条件：94°C1min,64°C1min,72°C85s，72°C10min,共30个循环。1.3.2流式细胞仪检测细胞凋亡收集6组实验组细胞约IX106个，PBS漂洗2遍，1200r/min,离心5min,弃去上清，

6、离心及弃上清步骤反复3次，之后加入已预冷的结合缓冲液并将细胞重悬，添加5yLPI及5pLAnnexinV到悬液中，混匀以后于4°C避光处理，染色10min,使用流式细胞仪进行细胞凋亡指数检测。1.4统计学方法采用统计软件SPSS18.0对数据进行分析，计数资料以shRNA-Survivin的重组质粒载体，通过脂质体转染进入HL-60细胞，结果表明，重组质粒能够明显抑制SurvivinmRNA表达，转染阴性质粒组与空白实验组表达没有显著性差异。细胞凋亡检测结果表明转染阳性质粒组细胞凋亡率显著高于转染阴性质粒组和空白实验组，

7、而转染阴性质粒组与空白实验组没有显著性差异，可能是因Sunrivin直接或间接影响半胱氨蛋白水解酶发挥作用，从而使细胞凋亡受抑制。干扰Sunrivin则可以促进细胞凋亡。相同剂量阿糖胞苷作用下，转染阳性质粒组细胞对Ara-C敏感性明显高于转染阴性质粒组和空白实验组。率表示，采用x2检验。以P本研究成功构建可表达综上所述，SurvivinsiRNA能够高效特异的抑制HL-60细胞内Survivin基因的表迗，诱导细胞凋亡，并提高了HL-60细胞对阿糖胞苷的敏感性。这为以Survivin作为标乾的肿瘤基因沉寂疗法在白血病治疗

8、中的应用提供了一定的基础理论支持，有助于白血病基因治疗的进一步发展。[参考文献][1]AmbrosiniG，AdidaC，AltieriDC,etal.Anovelanti-apoptosisgenesurvivin,expressedincancerandlymphoma[J].NatMed,1997，3(8)：9