塞来昔布对hl-60细胞增殖、凋亡的影响及其机制研究

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1、河北医科大学硕士学位论文塞来昔布对HL--60细胞增殖、凋亡的影响及其机制研究姓名：谢霞申请学位级别：硕士专业：内科学指导教师：郝洪岭201203中文摘要塞来昔布对HL-60细胞增殖、凋亡的影响及其机制研究摘要目的：急性白血病是造血系统常见恶性肿瘤，目前急性白血病的确切发病机制尚不明确，临床治疗仍以化疗为主，完全缓解率60．80％，但大多不可治愈，最终会死于白血病复发。对于急性白血病发病机制及治疗的研究，是恶性血液病研究领域的热点之一，其中有关细胞凋亡及细胞周期的调控机制是目前重要的研究内容。环氧化酶-2(cyclooxygenase-2，cox-2)为前列腺素合成过程中

2、的限速酶，其基因定位于1号染色体的1q2￡2瑙一，约8．3kb，由9个内含子和10个外显子构成，可编码604个氨基酸残基组成的多肽。大量实验证实，COX-2在多种白血病细胞均高表达，且具有一定的促细胞增殖、抗细胞凋亡、促血管新生及诱导细胞耐药的作用。细胞周期蛋白Dl(cycl／nDI)与El(cyclinEl)为公认的癌基因，在肿瘤的发生、发展中起调控作用。CyclinDl与细胞周期素依赖性激酶4／6(cyclindependentkinase4／6，CDK4／6)结合使抑癌基因pRb磷酸化，从而解除转录因子E2F家族的抑制作用，推动细胞由G1期进入S期，使得细胞增殖加速

3、。CyglinEl为一种癌基因，定位于19q12染色体，与CDK2结合形成CCNEl／CDK2复合物，使pRb磷酸化，调节细胞周期Gl—S期的过渡，促进细胞的增殖。塞来昔布作为一种选择性COX-2抑制剂，其抗白血病作用机制尚未明确。本研究通过体外培养急性髓系细胞白血病细胞株HL-60细胞，观察塞来昔布对HL．60细胞增殖、凋亡与细胞周期分布的影响，并检测COX-2、cyclinDl、cyclinElmRNA表达水平的变化，初步探讨塞来昔布抗白血病的可能机制。方法：不同浓度塞来昔布作用人急性白血病细胞株甩-60细胞24h后，系用CCK．8法测定细胞增殖活性，收集上述细胞进行

4、瑞特．吉姆萨染色，观察细胞形态变化，在上述实验基础上应用流式细胞技术分析细胞凋亡及细胞周期分布的变化，利用定量R1’-PCR的方法检测细胞周期蛋白Dl、El及COX．2mRNA的表达水平变化。所得结果运用SPSSl7．0统计中文摘要软件包处理，所有数据采用均数士标准差(；士s)表示，两样本均数的比较用t检验，多个样本均数的比较行单因素方差分析(ANOVA)，以LSD-t检验做多个样本均数间的两两比较，以ow0．05为显著性检验水准，IC50值的计算用回归分析。结果：l塞来昔布对HL-60细胞增殖的影响：终浓度为20、40、60、80、100、120、160umol／L的塞

5、来昔布分别作用于HL-60细胞24h，对}玎．一．60细胞增殖均有抑制作用，其抑制率分别为(17．31±1．15)％、(30．94±1．93)％、(48．84±1．69)％、(79．27±1．15)％、(89．18±1．73)％、(94．74±1．50)％、(94．60±0．87)％，24h的IC50值为63．037umol。各浓度组组间进行两两比较，120与160umol／L浓度组之间差异无统计学意义(p>o．05)，其他各组间差异有统计学意义(刚．05)。结果显示，塞来昔布对HL-60细胞有明显的增殖抑制作用，且呈现一定的浓度依赖性(相关系数r--0．955)。实验中

6、，120与160umol／L浓度组间差异无统计学意义(p>o．05)，其原因可能是在此浓度作用下HL-60细胞已被大量破坏所致。2塞来昔布作用下HL-60细胞形态学改变：收集CCK-8试验中的细胞涂片，进行瑞特．吉姆萨染色，在光学显微镜下观察，塞来昔布处理组细胞呈现典型凋亡形态学改变，表现为细胞体积缩小，核染色质浓聚，核固缩，核碎裂，核边集，可见新月核，凋亡小体形成，可见核发泡现象，细胞质内可见空泡，对照组细胞形态大致正常。120与160umol／L浓度组的细胞已被大量破坏，涂片镜下可见大量细胞碎片，已无完整的细胞结构。3流式细胞仪检测塞来昔布对HL-60细胞凋亡的影响：

7、20、40、60umol／L塞来昔布作用于HL．60细胞24h后，碘化丙啶染色，流式细胞仪检测细胞凋亡率分别为(10．04±0．15)％、(30．98±1．08)％、(57．15±0．69)％，均高于对照组(1．85±0．08)％(p