特异性结合革兰氏阴性菌外膜蛋白C的单链抗体核糖体展示文库的构建.pdf

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1、2015年第9期中国饲料DOI：10．15906／j．cnki．cnl1—2975／s．20150905特异性结合革兰氏阴性菌外膜蛋白C的单链抗体核糖体展示文库的构建王潇1,2,3王秀敏2,3，管庆丰2,3，滕达2,3，姚军虎，王建华2,3(1．西北农林科技大学动物科技学院，陕西杨凌712100；2．农业部饲料生物技术重点实验室，北京海淀100081；3．中国农业科学院饲料研究所基因工程研究室，北京海淀100081)【摘要]以纯化的重组大肠杆菌外膜蛋白OmpC免疫BALB／c小鼠，提取骨髓浆细胞总RNA，逆转录获得cDNA，作为模板通过PCR扩增获得重链和轻链可变区序列。

2、由(Gly4Ser)3linker连接两片段，获得单链抗体可变区片段基因库。重叠延伸PCP-添加T7启动子、核糖体结合住点、gilltether和两端茎环结构等元件，成功构建对外膜蛋白C具有特异性亲和力的单链抗体可变区的核糖体展示文库，为特异性强、亲和力高的单链抗体可变区筛选提供了技术和材料基础。构建能与革兰氏阴性菌外膜蛋白c特异性结合的鼠源单链抗体核糖体展示文库，是奠定构建饲料革兰氏阴性腐败茵分子预警和靶向抗菌剂的靶向定位区的高亲和力单链抗体可变区片段的重要基础．对建立有害革兰氏阴性茵分子检测方法和靶向抗革兰氏阴性茵茵剂设计方法具有借鉴作用[关键词】外膜蛋白C；单链抗体

3、可变区片段；核糖体展示；文库[中图分类号】$816．3[文献标识码】A【文章编号】1004-3314(2015)09—0019—04[Abstract】Inordertodevelopanewandefficientfeedgram-negativepathogensdetectionagentorguidingdomainforthedesigningofbactericidalantibodydrugconjugate，asinglechainantibodyfragment(scFv)libraryagainstoutermembraneproteinC(OmpC)

4、forribosomedisplaywasconstructedinthisstudy．Firstly．theBALB／cmicewereimmunizedwithOmpC．ThetotalRNAwasextractedfromthebonema~owplasmacells．andfollowedbybeingreversetranscribedtocDNA．Then，theheavy(VL)andlight(VH)chainvariableregionswereamplifiedbyPCRusingtheabovecDNAastem—plates，respectivel

5、y．BothVLandVHregionswerecombinedby(Gly4Ser)3linkerbyoverlappingPCR．r}lepromoterT7，ShineDalgarno(SD)，gllItetherandloopregionswerefusedintoonefragmentofscFvbytheoverlappingPCR．Finally，theScFvlibraryagainstOmpCwasconstructedsuccessfully．Theconstructionofribosomelibraryprovidedareliabletechni

6、calbasisforthescreeningofhighspecificityandhighaffinitybindingantibodyfragment．【Keywords]OmpC；asinglechainantibodyfragment；ribosomedisplay；library多种革兰氏阴性菌如大肠杆菌、志贺氏菌及对靶向抗菌剂的靶向效应具有结构决定作用。单沙门氏菌等均为饲料中常见病原菌，会引发腹泻、链抗体可变区片段(scFv)是轻链(VL)和重链败血症等疾病(周晓清，2012)。常规抗菌剂或者抗(VH)可变区通过(Gly4Ser)3linker连接而成的具菌

7、药多具广谱抗菌性，对正常菌群也有很强抑制有抗原亲和力的抗体片段，是靶向抗菌剂特异性效果．无差别性杀菌容易破坏肠道微生态环境，使靶向定位区的理想候选物之一(Pan等，2012；Ah—机体遭受二次感染(Mao等，2012)。而靶向抗菌剂mad等，2012)。能选择性杀灭目标菌，对正常细菌无作用或作用外膜蛋白C(OmpC)在多种革兰氏阴性菌膜较小(霍丽堵和凌均柴，2009)。特异性靶向定位区上均有分布，具有运输疏水性分子等生理机能，为耐药性关联蛋白．且能引发机体强烈的体液免疫反应并产生特异性抗体(Liu等，2012a、b)。核糖基金