抗 ICOSL 核糖体展示单链抗体库的构建.pdf

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1、安徽农业科学，JournalofAnhuiAsh．Sci．2013，41(33)：12819—12822责任编辑石金友责任校对李岩抗ICOSL核糖体展示单链抗体库的构建严浩，王芳，毛伟平，王文倩，孟素芳，邵峦峦，刘小精(南京师范大学生命科学学院，江苏省分子医学重点实验室，江苏南京210046)摘要[目的]构建出鼠源抗ICOSL核糖体展示抗体库。[方法]通过RT—PCR从人B淋巴瘤细胞Daudi的总RNA中扩增出ICOSL胞外区基因，并将此基因插入到原核表达载体pET28a中进行表达。以表达纯化的ICOSL蛋白为抗原免疫Balb／e小鼠，取小鼠脾脏提

2、取总RNA，通过RT—PCR扩增小鼠的重链可变区和Linker(VH—linker)序列，以及轻链可变区和Linker(VK—linker)序列。经重组PCR将两段基因连接起来，将VH／K与pMD19一T栽体链接产物转化E．coliDH5d，PCR鉴定并测序。[结果]VH和K链得到正确的扩增，长度分别为421和689bp，VH／K连接产物正确，连接产物长度为1079bp。[结论]所采用的引物及反应条件能够扩增出目的基因，成功构建了鼠源抗ICOSL核糖体展示抗体库，为进行核糖体展示体外筛选抗ICOSL特异性单链抗体奠定基础。关键词ICOSL(可诱导共

3、刺激因子配体)；单链抗体；核糖体展示技术；原核表达中图分类号S188文献标识码A文章编号o517—6611(2013)33—12819—04ConstruetionofAnti．ICoSLRibosomeDisplayLibraryYANHaoetal(JiangsuProvinceKeyLaboratoryofMolecularandMedicalBiotechnology，CollegeofLifeSciences，NanjingNormalUni—versity，Nanjing．Jiangsu210046)Abstractl0biective

4、]Anti．ICOSLribosomedisplay1ibrarywasconstructed．IMethodlThecDNAofICOSLextracellulardomainwasampli—fledfromDaudicellbyRT．PCR．TheICOSLgenewasinsertedintoplasmidpET28atoexpress．RNAfromthespleensofBalb／cmicewhichhadbeenimmunizedwithICOSLproteinwereselected．HeavychainandKchaingenes

5、(VHandK)wereamplifiedseparatelybyreversetranscfiptasepolymerasechainreaction(RT—PCR)，andtheanti—ICOSLVH／KchainribosomedisplaylibrarywasconstructedbyassemblingVHandKwithaspecialflexiblelinkerbyoverlapextensionPCR(SOE—PCR)．TheVH／KchainwasligatedintopMD19一Tvectorandtheli—gatedsam

6、plewastransformedintocompetentE．c0屁DH5Q．TheplasmidDNAwasidentifiedwithPCRandsequenced．1Results]VHandKwereamplifiedeo=eeflyandthelengthwere421and689bprespectively．VH／Kwasligatedcorrectlyandthelengthwas1093bp．IConclu—sion1Theprimersandreactionconditionwereabletogeneraterequiredg

7、enes．VH／Kchainribosomedisplaylibrarywasconstructedcorrectly．ItwasthebasisforscreeningsinglechainantibodyspecificforICOSLbyribosomedisplaytechnique．KeywordsICOS：Sing．chainantibody；Ribosomedisplay；ProkaryoticexpressionT细胞的活化需要2种不同信号的刺激，第1信号来自(无3’端终止密码子)在体外进行转录与翻译过程，在翻译其表面受体与抗原肽一

8、MHC分子复合物的特异性结合，即T的最后阶段，蛋白质、核糖体与mRNA分子结合在一起，形成细胞对抗原识别；T细胞活化的第2