一种大容量天然人源核糖体展示单链抗体文库的构建

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1、重庆医学2009年5月第37卷第9期1O53·论著·一种大容量天然人源核糖体展示单链抗体文库的构建陈锐，刘友生△，朱江，段光杰，葛晓冬(第三军医大学西南医院病理科，重庆4O0O38)摘要：目的构建大容量天然人源核糖体展示单链抗体(singlechainFv，scFv)文库，为抗体研究提供方便有效的技术平台。方法收集健康献血志愿者的白细胞悬液，离心分离单个核细胞，抽提其总RNA，逆转录成eDNA、PCR及重叠延伸PCR法构建scFv文库，并通过第2次重叠延伸PCR在scFvDNA序列5端添加T7启动子、茎环结构、核糖体结合位点，其3端添加6×His标签、间隔序列(基因UI)、茎环结构

2、等改造成核糖体展示天然人源scFv文库。结果成功构建了可用于筛选抗体的核糖体展示文库容量达10”以上。结论成功构建了大容量天然人源核糖体展示scFv文库，为筛选到高亲和力和特异性抗体提供了技术平台。关键词：核糖体展示；文库；天然人源单链Fv(scFv)抗体中图分类号：Q785；R392．1l文献标识码：A文章编号：1671—8348(2O09)09—1053—03ConstructionofalargenaivehumansinglechainFv(scFv)libraryforribosomedisplayCHENR“，LjUYou—sheng，ZHUJiang，eta1．(De

3、partmentofPathology，SouthwestHospital，ThirdMilitaryMedicalUniversity，Chongqing400038，China)Abstract：ObjectiveToconstructalargenaivehumansinglechainFv(scFv)libraryforribosomedisplay，whichprovidesaconvenientandeffectiveplatformforantibodyresearch．MethodsWhitebloodcellssuspensionofahealthydonorwe

4、recollectedandcentrifugedtoisolatemononuclearcells．AndtotalRNAofmononuclearcellswereisolatedandreversetranscribedtoconstructscFvlibrarybyPCRandoverlapextensionPCRamplification．AsecondoverlapextensionPCRamplificationwasusedtoaddT7promoter，stemloopstructure，ribosomebindingsitestothe5endand6×Hist

5、ag，spacer(gene1I)，stemloopstructuretothe3endofscFvDNAsequence．InthiswayanaivescFvlibraryforribosomedisplaywasconstructed．ResultsAlargenaivehumanscFvlibrarycontaining>10”membersforribosomedisplaywassuccessfullyconstructed．ConclusionThelargenaivehumanscFvlibraryforribosomedisplaywillbeausefulpla

6、tformforselectionofantibodieswithhighaffinityandspecificity．Keywords：ribosomedisplay；library；naivehumansinglechainFv(scFv)antibody抗体库技术是将基因工程与抗体生产技术相结合，通过建量PBS稀释后，按照淋巴细胞分离液使用说明书分离淋巴细立抗体基因文库进行表达和筛选特异性抗体的方法，所筛选出胞。对分离出的淋巴细胞以每管约1O个细胞将其分装入1．5来的抗体称为基因工程抗体。目前基因工程抗体应用与开发mLEppendorf管内，按TRIZOL法提取细胞总RNA。

7、利用的热点和难点在于寻找特异性强、亲和力高和人源性的小分子TaKaRaRNAPCRKit将淋巴细胞总RNA逆转录为eDNA。抗体。噬菌体抗体库是一种常用的小分子抗体筛选技术，与噬1．2．2引物设计与合成包括3组引物：(1)用于扩增抗体库菌体抗体库相比，核糖体展示文库是一种体外展示技术，具有轻链(1ightchainvariableregion，VL)和重链(heavychainvari—库容量大、建库周期短、筛选简便等优势，是一种具有应用前景ableregion，VH