人源单链抗体噬菌体展示文库的构建及抗LOX-1单链抗体的筛选

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1、人源单链抗体噬菌体展示文库的构建及抗Ｌ０Ｘ－１单链抗体的筛选Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆａｈｕｍａｎｈａｅｄｉｓｌａｌｉｂｒａｒａｎｄｐｇｐｙｙ－ｓｃｒｅｅｎ－ｖｉｎｇａｎｔｉＬＯＸ１ｓｃＦ作者姓名：孟兆丽专业名称：生物化学与分子生物学研究方向：蛋白质工程基础与应用基础研宄指导教师：谢秋宏教授学位类别：理学博士培养单位：生命科学学院论文答辩日期：２０１４年１２月４日授予学位日期：２０１４年１２月４日答辩委员会主席：胡耀辉教授论文评阅人：胡耀辉教授李青山教授池振明教授未经本论

2、文作者的书面授权，依法收存和保管本论文书面版本、电子版本的任何单位和个人，均不得对本论文的全部或部分内容进行任何形式的复制、修改、发行、出租、改编等有碍作者著作权的商业性使用（但纯学术性使用不在此限）。否则，应承担侵权的法律责任。吉林大学博士学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交学位论文，是本人在指导教师的指导下，独立进行研宄工作所取得的成果。除文中己经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研宄做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法

3、律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期７：＞／今年月ｆ日中文摘要人源单链抗体睡菌体展示文库的构建及抗ＬＯＸ－１单链抗体的筛选－ｘ凝集素样氧化低密度脂蛋白受体１ｌｅｃｔｉｎｌｉｋｅｏｉｄｉｚｅｄｌｏｗｄｅｎｓｉｔｌｉｏｒｏｔｅｉｎ（ｙｐｐｒｅｃｅｔｏｒ－－ｏｘｎｓ１ＬＯＸ１是氧化低密度脂蛋白（ｉｄｉｚｅｄｌｏｗｄｅｉｔｌｉｏｒｏｔｅｉｎ，ｏｘＬＤＬｐ，）ｙｐｐ）的主要受体ｋ－，分子量约为５０Ｄａ的ＩＩ型膜蛋白，属于Ｃ型凝集素家族。ＬＯＸ１－－ｅｘａｌｕｒ胞外结构域（ＬＯＸ１ｔｒｃｅｌｌａｄｏｍａｉ

4、ｎＬＯＸ１ＥＣＤ）被蛋白酶水解并释放到血，ＬＯＸ－－－－液中形成可溶性１（ｓｏｌｕｂｌｅＬＯＸ１，ｓＬＯＸ１）。ＬＯＸ１是动脉粥样硬化（Ａｔｈｅｒｏｓｃ－ｌｅｒｏｓｉｓＡｓ）及Ａｓ相关疾病的新型潜在药物耙点。此夕卜，通过ＬＯＸ１，－的靶向成像可实现动脉硬化斑块的定位和危险分层。因此，以ＬＯＸ１为靶点的抗体研发对于动脉硬化治疗具有重要意义。尤其是人源抗体在临床诊断和治疗中目前所报道的ＬＯＸ－更加安全、有效，是抗体研宄的热点。然而１抗，体多为动物。来源，人源抗体的研究报道极少噬菌体展示技术避免了杂交瘤技术所必需的动物免疫过

5、程，是体外获得人源抗体的重要手段。它的最大优势是可直接将抗体片段展示于噬菌体表面并与内部包裹的基因信息建立物理连接，便于操作。不同于完整免疫球蛋白分子，单链抗体（ｓｉｎｇｌｅｃｈａｉｎｖａｒｉａｂｌｅｆｒａｍｅｎｔ，ｓｃＦｖ）是由重链可变区ＶＨ和轻链可变区ＶＬ经ｇ一工程小分子抗体由段氨基酸肽段（Ｌｉｎｋｅｒ）连接而成的基因。ｓｃＦｖ分子量小，免疫原性小，且在组织和肿瘤的渗透性强，在动脉硬化斑块的成像、治疗上具有ｘ８－相当的优势。本文为获得抗ＬＯＸ１全人源ｓｃＦｖ了库容量为６．２ｌ〇的人源，构建＂６一ＸｓｃＦｖ噬菌体展示文

6、库株亲和常数为５．８１０Ｍ的单链抗，并从中筛选获得了－ｓｃＦｖ－３９体，本研究为以ＬＯＸ１人源抗体为核心的治疗动脉粥样硬化药物的研发奠定了基础。首先－Ｄ蛋白的，本研宄采用大肠杆菌原核表达系统成功地实现了ＬＯＸ１ＥＣ大量可溶性表达并采用ＭＢＰ亲和层析和分子筛纯化方法获得了纯化的ＬＯＸ－１，ＥＣＤ。通过对宿主细胞和促溶标签的系统性优化，结果表明在宿主细胞Ｒｏｓｅｔａａ－ｍｉ２ＤＥ３中ＬＯＸ１ＥＣＤ与ＭＢＰ标签融合表达时，融合蛋白的可溶性表达ｇ（），Ｉ°－－产量最高。通过表达条件优化后发现，ＭＢＰＬＯＸ１ＥＣＤ融合蛋

7、白在３０Ｃ条件ＩＰＴＧ诱导可溶性表达产量最高。本文通过ＭＢＰ下培养，采用２００ｐＭ的，蛋白的－－亲和层析和分子筛的纯化，获得了纯化的融合蛋白ＭＢＰＬＯＸ１ＥＣＤ。采用浓度－为２．５Ｕ／ｍ血酶作用于ＭＢＰ和ＬＯＸ１ＥＣＤ蛋白之间的氨基酸识别位点ｇ的凝，有效地去除融合蛋白中的ＭＢＰ标签。再通过ＭＢＰ亲和层析和分子筛结合的纯９５％－ＥＣＤ化方法获得了纯度为的ＬＯＸ１蛋白，并具有较高的ｏｘＬＤＬ结合活性。一ｓｘ其次．２１０，采用分子生物学和基因工程的方法构建了个容量为６人源ｓｃＦｖ嗤菌体展示文库。本文分离２０名心血管病人ＰＢ

8、ＭＣＰｅｒｉｐｈｅｒａＩＷｏｏｄ（ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒｃｅｌｌ，ＰＢ