抗速灭威噬菌体单链抗体库的构建、筛选及鉴定.pdf

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1、第5O卷第9期湖北农业科学Vo1．50No．92011年5月HubeiAgricuhuralSciencesMav．．2011抗速灭威噬菌体单链抗体库的构建、筛选及鉴定李铁军．李德全(1．南通职业大学化工与生物工程学院，江苏南通226007；2．南通大学生命科学学院，江苏南通226007)摘要：以速灭威抗原免疫的小鼠为实验对象，取其脾细胞，RT—PCR扩增抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因。重叠延伸PCR拼接单链抗体(ScFv)基因，克隆入噬菌粒表达载体pCANTAB5E并转化大肠杆菌TG1．成功构建了库容约7．6xlO5的抗速灭威噬茵体ScFv库对该文

2、库进行了5轮“吸附一洗脱一扩增”的富集筛选．获得了6个特异性较强的抗速灭威噬茵体ScFv阳性克隆其研究结果为速灭威特异性抗体的大量制备奠定了一定的基础关键词：速灭威：单链抗体：噬茵体展示中图分类号：Q819文献标识码：A文章编号：0439—8114(2011)09—1908—05Construction，ScreeningandIdentificationofPhageScFvLibraryAgainstMetolcarbLITie-jan，LIDe-quan2(1．ChemicalandBiologicalEngineeringInstitute，NantongV

3、ocationalCollege，Nantong226007，Jiangsu，China2．CollegeofLifeScience，LifeandScienceCollegeofNantongUniversity，Nantong226007，Jiangsu，China)Abstract：Balb／CmicewereimmunizedwithahaptenconjugateofMetolcarb，andtheirspleencellswereharvested．VHandVLgeneswereamplifiedbyRT-PCR．VHandvLwerematchedi

4、ntoscF￡byovedapextensionPCR．andclonedintopCANTAB5Eexpressionvector，andthentransformedTG1cells．Thusthephagesingle—chainFv(ScFv)librarywithasizeofabout7．6x10wassuccessfullyconstructed．Thelibrarywasbiopannedby5roundsofbinding—elution—enrichmentprocedure：and6positivecloneswithhighspecifici

5、tyforMetolcarbwereobtained．Theresuhsgeneratedcouldbethefoundationforlarge—scaleproductionofspecificantibodiesagainstMetolcarb．Keywords：metolcarb；singlechainFv(ScFv)；phage—display速灭威(Metolcarb．3一甲苯基一Ⅳ一甲基氨基甲酸直是制约免疫分析法在农药残留分析领域应用的酯)是氨基甲酸酯类杀虫剂．具有触杀和熏蒸作用．瓶颈因素。与传统的多抗和单抗制备技术相比．第主要用于稻田、蔬菜、水果及经

6、济作物等的害虫防三代抗体制备技术——噬菌体抗体库技术具有基治虽然速灭威为中等毒杀虫剂．但农产品上残留因型与表型相统一、选择与扩增相统一的优点，它的速灭威仍会对人体健康造成潜在的危害．有必要不仅可以绕过繁琐的杂交瘤制备过程．甚至可以省对其进行持续的监控检测⋯略动物免疫的步骤．使得建立各种文库以及体外筛目前定量分析速灭威残留的主要方法是气相选任何目的分子的重组抗体成为可能。因此，噬菌色谱(GC)和高效液相色谱(HPLC)等仪器分析法，体抗体库技术为化学农药抗体的制备开拓了新的但这些方法必须对样品进行步骤冗长的纯化处理．思路。很难达到快速、简便的现场检测要求；与仪器分析本

7、研究利用噬菌体展示技术．构建抗速灭威噬相比，免疫分析法具有快速、简单、灵敏、价廉等优菌体ScFv库．从中筛选与速灭威特异性结合的噬菌点．可用于现场快速检测，具有广阔的应用前景和体ScFv阳性克隆．为进一步实现速灭威免疫快速检开发潜力[测提供大量制备特异性抗体的新途径。目前，国内抗体作为免疫分析的核心试剂．其制备技术一外有关速灭威ScFv制备的研究尚未见报道收稿日期：2010—07—3l作者简介：李铁军(1972一)，男，江苏南通人，讲师，博士，主要从事基因工程抗体和农药残留免疫分析技术研究，(电话)15996542736(电子信箱)relefa@126．con。