抗Ⅰ型鸭肝炎病毒RdRp蛋白噬菌体单链抗体库构建及单链抗体的淘选.pdf

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1、第37卷第5期中国预防兽医学报VO1．37．No．52015年5月ChineseJournalofPreventiveVeterinaryMedicineMay．2015doi：10．3969~．issn．1008-0589．2015．05．03抗I型鸭肝炎病毒RdRp蛋白噬茵体单链抗体库构建及单链抗体的淘选王永娟，一，李碧春，沈明君，洪伟鸣，左伟勇’(1．扬州大学动物科学与技术学院，江苏扬州225009；2．江苏农牧科技职业学院江苏省兽用生物制药高技术研究重点实验室，江苏泰州225300)摘要：为构建抗1型鸭肝炎病毒(DH

2、V．1)RdRp蛋白的单链抗体(scFv)库，并淘选特异性scFv，本研究采用RT．PCR方法从DHV．1基因组中扩增RdRp基因，将其克隆于pET．32a载体中进行重组RdRp蛋白原核表达。将纯化的重组蛋白免疫小鼠，以提取的免疫鼠脾脏总RNA为模板，利用抗体轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)简并引物，经RT．PCR扩增抗体的VL和VH编码序列，由Linker序列连接，通过重叠延伸PCR(SOE．PCR1扩增完整的scFv基因(VI_-Linker-V．)。将扩增的seFv基因克隆于pCANTAB5E载体中构建噬菌体sc

3、Fv文库，利用纯化的重组RdRp蛋白开展4轮吸附．洗脱．富集以淘选抗RdRp的ScFv；最后对淘选到的阳性ScFv进行可溶性表达，以ELISA方法检测其免疫结合活性。结果显示，获得了7株具有良好抗原结合活性的ScFv。淘选到的DHV．1RdRp特异的基因工程ScFv，为鸭病毒性肝炎防制新策略研究奠定了基础。关键词：1型鸭肝炎病毒；RdRp；噬菌体抗体库；单链抗体中图分类号：$852．65文献标识码：A文章编号：1008．0589(2015)05．0334．05ConstructionoOftphagesingle．一chai

4、nantibody(scFl-v)1IibraryforRdRPproteinofduckhepatitisvirustype1andthespecificscFvpanningwANGYong-juan，一，LIBi-chun，SHENMing-jun，HONGWei—ming2，ZUOWei—yonf(1CollegeofAnimalScienceandTechnology，YangzhouUniversity，Yangzhou225009，China；2．JiangsuProvincialKeyLaboratoryof

5、VeterinaryBio-pharmaceuticalHighTechResearch，JiangsuAgri—animalHusbandryVocationalCollege，Taizhou225300，China)Abstract：Toconstructphagedisplaymurinesingle—chainantibodyvariablefragment(scFv)libraryforRdRpproteinofduckhepatitisvirustype1(DHV一1)andscreenthespecificsc

6、FvagainstRdRp，theRdRpgenewasamplifiedfromthegenomicRNAofDHV-1byRT—PCRmethodandclonedintopET一32avectorforexpressioninE．coil．Then，micewereimmunizedwiththeexpressedrecombinantRdRp，andtotalRNAwasextractedfromthespleenofimmunizedmicetoamplifythevariableregionsencodingse

7、quencesoftheheavy(VH)andlightchains(V0withdegenerateprimersbyRT—PCR．Inaddition，thecompletesequenceofscFvwasamplifiedwithalinkersequencebySOE—PCR．Furthermore，scFvsequenceswereclonedintopCANTAB5EvectortoconstructthescFvphagedisplaylibrary．Eventually，usingpurifiedreco

8、mbinantproteinRdRpaspanningantigen，sevenScFvswiththebindingafinitytoRdRpwereidentifiedafter4roundsofprocedurebinding-elution—enrichmentbyELISA．In