抗猪脂肪细胞膜单链抗体抗体库的构建及表达

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1、山东农业大学硕士学位论文抗猪脂肪细胞膜单链抗体抗体库的构建及表达姓名：丁淑燕申请学位级别：硕士专业：预防兽医学指导教师：朱瑞良;苗向阳20040520关于学位论文原创性和使用授权的声明本人所呈交的学位论文，是在导师指导下，独立进行科学研究所取得的成果。对在论文研究期间给予指导、帮助和做出重要贡献的个人或集体，均在文中明确说明。本声明的法律责任由本人承担。本人完全了解山东农业大学有关保留和使用学位论文的规定，同意学校保留和按要求向国家有关部门或机构送交论文纸质本和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权山东农业大学可以将本学位论文的全部或部

2、分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。保密论文在解密后应遵守此规定。论文作者签名：丁漆茁、导师签名：娑移串莎日期：2004．5．20山东农业大学硕士学位论文抗猪脂肪细胞膜单链抗体抗体库的构建及表达摘要为研究、大量制各高亲和力抗猪脂肪细胞膜抗体，本实验从分子生物学和基因工程抗体技术的角度出发，首先构建出抗猪脂肪细胞膜单链抗体，然后将单链抗体与噬菌体载体pCANTAB5E连接，连接产物转入感受态大肠杆菌TGl，构建出抗猪脂肪细胞膜抗体库，经过淘选使得抗猪脂肪细胞膜抗体得以富集。ELISA检测

3、鉴定富集效果，选择阳性克隆进行酶切鉴定。挑取阳性克隆在大肠杆菌岫2151中表达，并对表达产物进行鉴定。本研究做了以下几方面的内容：1构建抗猪脂肪细胞膜抗体库在本实验室其他人员所构建的抗猪脂肪细胞膜单链抗体(Smg：echainIv,ScFv)的基础上，用SfiI和NotI将ScFv的两端酶切，克隆入同样用SftI和NotI酶切的噬菌体载体pCANTAB5E，CaCl2转化法将连接好的载体转入感受态大肠杆菌TGl，构建抗猪脂肪细胞膜噬菌体抗体库。2对所构建的抗体库进行筛选抗体库经辅助噬菌体援救后，用特异性抗原脂肪细胞对其进行筛选，每轮筛选

4、过后取噬菌体抗体库少量感染的E．ColiTGl，涂板培养计算抗体滴度。筛选4轮使抗猪脂肪细胞膜抗体得以富集。制备重组噬菌体抗体，用ELISA检测。3筛选出的抗体库阳性克隆在大肠杆菌中进行表达4轮筛选过后的抗体库在SOBAG培养后挑取单菌落制备重组噬菌体，ELISA法进行检测。产生的抗体的阳性克隆用大肠杆菌HB2151在IPTG的诱导下进行抗猪脂肪细胞膜单链抗体抗体库的构建及表达表达，提取出E．ColiHB2151周质腔的表达产物，分别用ELISA和SDS—PAGE检测。通过实验，我们成功地将单链抗体与噬菌体载体pCANTAB5E连接，并

5、转染于大肠杆菌TGl，构建出了抗猪脂肪细胞膜单链抗体抗体库，对所构建的抗体库进行4轮筛选过后，抗体得到明显富集，最终获得库容量为6．7×107pfu／ml的中等库容的抗体库。将抗体库中鉴定为阳性的克隆表达于大肠杆菌I-'1132151，提取周质腔产物进行鉴定，ELISA和SDS—PAGE检测结果表明：我们所构建的抗猪脂肪细胞膜抗体库中的抗体可以在大肠杆菌中表达，但是表达量有限。关键词：猪，脂肪细胞膜，单链抗体，噬菌体展示技术，噬菌体抗体库技术2坐查查些查堂堡主堂鱼笙兰一——ConstructionandExpressionofScFvA

6、ntibodyLibraryagainstPorcineAdipocytePlasmaMembraneAbstractInthisresearch，wesUmr'tonthebaseofmolecularbiologyandgeneengineeringantibodytechnologyinordertoinvestigateandlargelyproducellighaffinityantibodyagainstporcineadipocyteplasmamembrane(APM)．SinglechainFv(ScFv)agains

7、tporcineAPMisconstructed．TheScFvgeneisclonedintophagemidvectorpCANTAB5EandE．coliTGIcompetentcellsRretransformed．TheclonesselectedonSOBAGplatesaresuperinfectedbyM13K07helperphage．Theanti-porcineadipocyteScFvphagelibrarywasestablished．ARer4timesscreeningwecanmaketheantibod

8、ygetenrichment,detectitwithELISAtoidentifytheeffectofenrichment，takethepositiveclonestodigestbyenzymean