抗GBM抗体特异性单链抗体scFv3原核表达载体的构建及表达.pdf

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1、ISSN1007—8738志(ChinJCellMolImmuno1)2010，26(3255·论著·文章编号：1007—8738(2010)03-0255-03抗GBM抗体特异性单链抗体scFv3原核表达载体的构建及表达王雅楠，刘章锁，邢国兰，赵国强，肖静，王沛(郑州大学第一附属医院肾内科，河南郑州450000)[摘要]目的：构建单链抗体scFv3的原核表达载体1材料和方法pET28a．scFv3并诱导表达，纯化并检测表达产物的免疫抗原1．1材料抗GBM抗体的单链抗体scFv3的基因片段是在性。方法：用PC

2、R扩增抗肾小球基底膜(GBM)抗体单链抗体北京大学第一医院通过噬菌体展示技术筛选所得。克隆载体scFv3基因，构建pGEM．scFv3重组质粒并测序。将重组基因pGEM．TEasyVector购自Promega公司，表达载体pET28a亚克隆于原核表达载体pET28a(+)中，转化大肠杆菌BI21(+)购自Novagen公司。大肠杆菌Topl0、BL21(DE3)均来(DE3)，IPTG诱导表达，亲和层析法纯化，用间接ELISA检自郑州大学基础医学院微生物学与免疫学教研室保存。限制测纯化的单链抗体scFv3的

3、免疫抗原性。结果：酶切和测序证性内切酶EcoRI、XhoI、TaqDNA聚合酶、3"4DNA连接酶购实得到的scFv3基因序列正确。间接ELISA检测表明，纯化自美国Promega公司。胶回收试剂盒及小量质粒提取试剂盒获得的scFv3能与抗GBM抗体结合。结论：成功构建了购自德国Qiagen公司。HisLinksoin蛋白纯化系统试剂盒购pET28a—seFv3原核表达系统并获得纯化的scFv3蛋白。表达自美国Promega公司。酶标(HRP)鼠抗人IgG抗体购自美国产物具有良好的抗原性，为进一步研究该单链抗

4、体在抗GBMSantaCruz公司。抗体病中的治疗作用奠定了基础。1．2方法[关键词]pET28a—scFv3；蛋白表达；纯化；抗GBM抗体1．2．1引物设计与合成单链抗体scFv3基因PCR扩增引[中图分类号]Q782[文献标识码]B物由上海博尚生物技术有限公司合成。序列如下：上游引物P1：5一AGAATTCATGAG兀T兀'GITI’CTGCGGCCGCACCIlAG-3，抗肾小球基底膜(glomerularbasementmembrane，下游引物P2：5一CCTCGAGCTA兀TCAAGGAGACAG

5、TCATA．GBM)抗体疾病是在一定的诱因和遗传背景条件下，ATG一3。由体液免疫和细胞免疫共同介导的自身免疫性疾1．2．2重组表达质粒pET28a-scFv3的构建以重组噬菌粒病j。其特点是外周血中有抗GBM抗体和(或)肾pCANTAB—scFv3为模板，Pl和P2为引物，扩增出含有克隆入表达载体酶切点的单链抗体scFv3基因片段。PCR反应条活检肾小球基底膜上有抗GBM抗体线性沉积。实验件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，57℃退火30s，发现，抗GBM抗体主要与肾小球基底膜Ⅳ型胶原372~C延

6、伸40s，共35次循环，再72~(2延伸5min。PCR产物链的非胶原区1[3(Ⅳ)NC1]结合，触发补体和多回收后克隆到pGEM-TEasy载体，转入感受态细菌Topl0，过种趋化因子释放而发病。因此，抗GBM抗体对抗肾夜培养，通过蓝白筛选，选出阳性菌落，提取质粒进行酶切小球基底膜疾病的发生发展有重要意义J。目前临鉴定，同时送至上海博尚生物技术有限公司进行测序。测序床抗GBM病的主要治疗方法是强化血浆置换和免疫正确后，用EcoRI、XhoI双酶切，与同样酶切的表达载体抑制联合J。迄今为止，国内外尚无通过噬菌

7、体展pET28a(+)进行连接，转人大肠杆菌BL21(DE3)，获得插入示技术制备单链抗体来中和致病的抗GBM抗体的治scFv3基因的重组子pET28a—scFv3。疗研究。1．2．3scFv3的诱导表达将pET28a—scFv3转化的BL21为了探索抗GBM病新的治疗方法，本研究构建(DE3+)单菌落接种人含100mg／L卡那霉素的LB培养基了能识别抗GBM抗体的单链抗体scFv3的原核表达中，37~C振摇培养至A600为0．7～0．9，加终浓度为1mmol／L的IPTG在30℃诱导表达20h。载体，在大肠

8、杆菌BL21(DE3)高效表达后，通过亲1．2．4scFv3蛋白的制备和纯化取1mL诱导表达菌液，和层析技术纯化表达产物，用SDS—PAGE和ELISA12000r／min多次离心1min收集沉淀，再用1mL菌液定容。对其进行初步的分析，为进一步研究该单链抗体用超声破碎仪破碎诱导表达菌。破碎条件为功率200W，超scFv3的治疗作用奠定了基础。声时间3s，间隔时间3S，超声次数3次，循环7次。超声破