抗HIV-1 gp120单链抗体导向SEAD227A融合蛋白原核温控型表达载体构建及表达.pdf

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1、高技术通讯2004.11抗HIV-1gp120单链抗体导向SEAD227A融合蛋白原核温控型表达载体构建及表达!王宏＠!!!金宁一＠!金洪涛!张立树!江文正!徐一鸣!连海!（!中国人民解放军军需大学军事兽医研究所全军基因工程重点实验室长春130062）（!!暨南大学生命科学技术学院广州510632）摘要人工合成了能广泛识别HIV-1gp120的单链抗体（ScFv120）基因和金黄色葡萄菌外毒素A（SEA）基因，将SEA基因第227位编码As（pD）的密码子GAT转换成编码Al（aA）的密码子GCT，并对两基因进行密码子优化。构建原核温控型表达质粒pBV-120和pBV-SL120，经条件

2、优化，pBV-120和pBV-SL120分别在E.coliBL21（DE3）plys中44C诱导61、42C诱导71获得最佳表达，表达量分别占菌体总蛋白的27.673%和32.519%。目的蛋白经包涵体洗脱、分子筛层析折叠复性后可与HIV-1抗原条发生良好的结合反应。关键词HIV，gp120，单链抗体，金黄色葡萄菌外毒素A，表达E.coliBL21（DE3）plys为本室保存菌种；pKS-120、0引言pMD-S等质粒基因合成获得。自1981年世界上发现第一例艾滋病感染者以1.2工具酶及生化试剂来，艾滋病已传入所有国家和地区，现已成为威胁人各种限制性内切酶、碱性磷酸酶、连接酶等分别类生命

3、的第四大杀手。虽然高效抗病毒疗法（Hig1ly购自TaKaRa公司和GIBCOBRL公司。碱性磷酸酶adctiveanti-retrovirolt1erapy，HAART）可有效地抑制标记的羊抗鼠IgG抗体和NBT/BCIP为Promega公司其病原HIV-1的复制，基本上清除血清中游离的病产品。抗HIV-1gp120单克隆抗体由本室保存。低毒粒子，但却不能根除，原因是在静止的CD+分子量标准蛋白质（分子量分别为97.4kDa，4T记忆淋巴细胞中存在HIV-1潜伏感染［1］。在各种免疫66.2kDa，43kDa，31kDa，20kDa，14kDa）购自上海西调节剂中，超抗原SEA是已知潜

4、力最大的激活T淋巴斯生物技术开发有限公司。HIV-1抗原硝酸纤维巴细胞的因子。SEA激活表达TCRV成分的T细膜条购自杭州澳亚生物有限公司。用于扩增SEA）胞，一方面活化的辅助性/杀伤性T细胞和抑制性/基因的引物（上游引物：5’-GGCCATGGAGCGA-细胞毒性T细胞可发挥杀伤作用［2］，另一方面是活GAAAAGCG-3；下游引物：5’-GGAGATCTAGATC-化的T细胞分泌INF-Y、TNF-a、IL-2和IL-6等细胞因CGCCTCCACCACTTGTATATAAATATATAGC-3’）由上子，可直接产生杀伤作用［3］。目前SEA用于肿瘤免海生工公司合成。疫治疗得到广泛研究

5、，并且疗效显著。利用SEA治1.3基因合成疗HIV/AIDS的研究国内外尚未见报导。本研究进人工合成能广泛与HIV-1gp120结合的单链抗行了抗HIV-1gp120单链抗体基因与超抗原SEA基体基因（ScFv120）和葡萄球菌外毒素A（SEA）基因［4，5］，并将SEA第227位编码Asp（D）的密码子因原核融合表达，对目的蛋白进行了复性和初步纯［6］，同时对两化，并对单链抗体的结合活性进行GAT转换成编码Al（aA）的密码子GCT了检测。基因进行密码子优化。1.4PCR扩增SEA基因1材料与方法以质粒pMD-s为模板，94C预变性5min后，按1.1菌株与质粒94C变性30s、55C

6、退火50s、72C延伸1min的参数E.coliDH5a、E.coliJM109、扩增30个循环，最后72C延伸10min。t863计划项目（2003AA219051）；吉林省重点资助项目（20010404）。＠女，1976年生，博士；研究方向：分子病毒学。＠联系人。（收稿日期：2003-12-25）—38—王宏等：抗HIV-lgpl20单链抗体导向SEAD227A融合蛋白原核温控型表达载体构建及表达1.5重组表达质粒构建（mmOl/L）/0.（3mmOl/L））和75%的bufferB（bufferB：按常规方法进行。8mOl/L的urea溶于bufferA中）来平衡柱子，再逐渐1.6

7、重组蛋白表达增加bufferB的浓度直到l00%B，加入样品后继续重组表达质粒分别转化宿主菌E.coliDH5!、用l00%B进行洗脱。E.coliJMl09、E.coliBL2l（DE3）plys感受态细胞，1.9目的蛋白抗原结合活性测定30C培养至OD=0.8时，于不同温度、不同时间及利用HIV-l抗原硝酸纤维膜条，采用Western加蛋白酶抑制剂条件下诱导表达。blOtting方法检测单链抗体的抗原结合活性。1.7目的蛋白表达