抗新城疫病毒单链抗体（scfv）载体构建及表达研究

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3、指导教师卢克焕教授陆阳清研究员论文答辩日期２０１５年５月２０日学位授予日期员答辩委员会主席石德顺研究广西大学学位论文原御性和使用授权声明本人声明所呈交的论文，是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除己特别加Ｗ标注和致谢的地方外，论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的研巧成果，也不包含本人或他人为获得广西大一学或其它单位的学位而使用过的材料。与我同工作的同事对本论文的研究工作所做的贡献均己在论文中作了明确说明。本人在导师指导下所完成的学位论文及相关的职务作品，知识产权归目属广西大学。本人授权广西大学拥有学位论文的部分使用

4、权，Ｐ：学校有权保存并向国家有关部口或机构送交学位论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可Ｗ将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播、汇编学位论文。，可Ｗ采用影印、缩印或其它复制手段保存本学位论文属于；□保密。，在年解密后适用授权／■ｑ不保密。＂＂请在Ｗ上相应方框内打Ｖ）（．．６？论文作者签名：義和先曰期：兴沁指导教师签名日期￣—作者联系电话；电子瞧：：抗新城疫病毒单链抗体（ｓｃＦｖ）載体构建及表达硏究摘要ＮＤＶ一新城疫）引起的（ＮＤ）是由新城疫病毒（类禽类呼吸道疾病，感染宿主高度致死，因此对中国乃

5、至全球的家禽业造成巨大的威胁，至今仍无特异性治疗药物。单链抗体（ｓｃＦｖ）是免疫球蛋白最小的功能性结构单元，具有抗原结合活性，且在脊椎动物与非脊椎动物中均能表达。单链抗体除了应用于医学诊断与治疗，还具有中和病毒的能力。本研巧探索利用ＰｉｇｇｙＢａｃ转座子系统构建抗新城疫病毒单链抗体真核表达载体，分别为－－－－－－－Ｂ３１５ＢＣＡＧ－ｕｒｏＧＦＰｓｃＦｖＢ３ＫＢＥＦｌａｕｒｏＧＦＰｓｃＦｖｐｐｐ、ｐｐｐ。通过脂质体Ｌｉｏｆｅｃｔａｍｅ？２０００将构建的两个重组质粒分别转染ＤＦ－１巧３Ｔ细ｐｉｉｉ细胞和－－ＤＦ１ＣＡＧ－ｓｃＦｖ、胞，获得了稳定转染抗新城

6、疫病毒单链抗体的－－－－－－－２９３ＴＣＡＧｓｃＦｖ、ＤＦ１邸ｌａｓｃＦｖ与巧３Ｔ邸ｌａｓｃＦｖ等４种细胞系。－巧３Ｔ细１９ＰｉｇｇｙＢａｃ转座子系统在ＤＦ１和胞中的转座效率分别为．１％和２５－．８％。ＲＴＰＣＲ结果表明，抗新城疫病毒单链抗体基因在４种细胞中均检测到ｍＲＮＡ。通过ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测与抗新城疫病毒单链抗体融合的甜Ｓ标签蛋白来确定其在各细胞系中的表达情况，结果表明，在上述４种转染细Ｈ－－－胞的裂解液中均没有检测到ｉｓ标签蛋白，然而在ＤＦ１ＥＦｌａｓｃＦｖ和ＤＦ－１－ＣＡＧ－ｓｃＦｖ细胞上清中有ｓｃＦｖ表达，前者含量高于后者。利用

7、６倍、－１－－－６０倍、６００倍ＴＣＩＤ５０的新城疫病毒分别感染ＤＦ、ＤＦ１ＣＡＧｓｃＦｖ和ＤＦ－－－６０ＴＣＩＤ５０１ＥＦｌａｓｃＦｖ细胞。结果表明，当新城疫病毒量为与Ｉ６００ＴＣ－－－ＣＡＧ－ｓｃＩＤ５０时，ＤＦ１与ＤＦｌＦｖ细胞发生病变的孔数明显多于－－－ＤＦ１ＥＦｌａｓｃＦｖ。本实验表明，ＥＦｌａ启动子对单链抗体的表达翻译效果更ＤＦ－１好，利用该启动子构建的新城疫病毒单链抗体能够在细胞中稳定表达，。ａ并分泌到细胞外，具有良好的抗新城