单链抗体a7基因真核表达载体的构建

单链抗体a7基因真核表达载体的构建

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1、单链抗体A7基因真核表达载体的构建【摘要】[目的]构建抗乙酰胆碱受体主要免疫原区单链抗体A7基因的真核表达载体,为单链抗体A7基因的真核表达及基因治疗重症肌无力奠定基础.[方法]应用PCR技术,从已构建的含有抗乙酰胆碱受体主要免疫原区单链抗体A7基因的重组原核表迗载体pHEN2单链抗体A7上扩增单链抗体A7基因并纯化,将纯化后的PCR产物经EcoRI和AvrII双酶切后,用低熔点琼脂糖凝胶电泳回收并纯化,再与经同样酶切并纯化的真核表达载体pPIC9K连接,将其产物转化至大肠杆菌DH5a后扩增,再用AvrII和EcoRI酶切和测定序列检查ScFvA7基因

2、插入的准确性.[结果]构建pHC9K_ScFvA7重组载体,经序列测定检查核苷酸序列正确,且ScFvA7基因准确地克隆至载体开放读码框架内.[结论]成功地构建了抗乙酰胆碱受体主要免疫原区单链抗体A7基因的真核表迗载体.【关键词】重症肌无力;抗体;真核表迗载体ABSTRACT:OBJECTIVEToconstructarecombinanteukaryoicexpressionveinvariablefragmentagainstthemainimmunogenicregion(MIRceptor(AChR)forthectorofthesinglech

3、a(ScFv)A7ofantibody)ofacetylcholinerefurthereukaryoicexpressionandthegenetherapyinmyastheniagravis(MG).METHODSTheScFvA7genewasamplifiedbyPCRfromtherecombinantprokaryoticexpressionvectorpHEN2-ScFvA7,thenpurifiedanddigestedwithEcoRIandAvrII.Thedigestedproductswererunin1owme11ingpo

4、intagarosegeleletrophoresisandpurifiedbyWizardPCRPrepsDNAPurificationSystem,thenligatedintoeukaryoticexpressionvectorpPIC9Kdigestedandpurifiedbythesamemethod.TherecombinantvectorpPIC9K_ScFvA7wastransformedintoE.coliDH5aforamp1ificationandisolatedanddigestedwithAvrIIandEcoRIagain

5、.ThepPIC9K_ScFvA7genewasanalysedforaninsertoftherightsizebydigestionwithAvrIIandEcoRI.RESULTSThesequencingshowedthatthenucleotidesequenceofconstructedScFvA7wascorrectandclonedintotheopenreadingframe(ORF)inpPIC9K.CONCLUSIONTherecombinanteukaryoicexpressionvectorpPIC9K-ScFvA7hashe

6、ensuccessfullyconstructed.Keywords:myastheniagravis;antibodies;eukaryoticexpressionvector重症肌无力是抗乙酰胆碱受体抗体介导的器官特异性自身免疫病,AchR是由a20YS等5个同源亚单位组成的跨膜糖蛋白[1].现已发现,重症肌无力患者血清中2/3的抗AchR抗体针对的是a亚单位的主要免疫原区的第67〜76位氨基酸表位[2].当致病性抗体与神经肌肉接头处突触后膜上相邻2个AchRa亚单位上的主要免疫原区结合后,通过抗原调变或激活补体作用使突触后膜损伤[3],AchR数

7、量减少,结果出现受累肌肉收缩无力及麻痹症状[4].由抗AchR抗体制备的单链抗体作为单价片段,只能与1个a亚单位上的主要免疫原区结合,不引起抗原调变作用,且单链抗体无可结晶片段,不能激活补体导致AchR损伤.但单链抗体与主要免疫原区结合后,可特异性地封闭抗AchR抗体的结合位点,从而对AchR起到保护作用.本实验将构建在原核表迖载体克隆至真PHEN2上的抗AchR主要免疫原区单链抗体A7基核表达载体PPIC9K上,构建了重组真核表达载体.1材料与方法菌种与载体肠杆菌DH5a由荷兰马斯特里赫特大学医学院神经学系神经免疫学实验室提供,载体质粒pPIC9K由

8、军事医学科学院输血研究所章金刚教授惠赠,大肠杆菌HB2151由本实验室构建.试剂WizardP

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