单链抗体a7基因真核表达载体的构建

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1、单链抗体A7基因真核表达载体的构建【摘要】［目的］构建抗乙酰胆碱受体主要免疫原区单链抗体A7基因的真核表达载体，为单链抗体A7基因的真核表达及基因治疗重症肌无力奠定基础.［方法］应用PCR技术，从已构建的含有抗乙酰胆碱受体主要免疫原区单链抗体A7基因的重组原核表迗载体pHEN2单链抗体A7上扩增单链抗体A7基因并纯化，将纯化后的PCR产物经EcoRI和AvrII双酶切后，用低熔点琼脂糖凝胶电泳回收并纯化，再与经同样酶切并纯化的真核表达载体pPIC9K连接，将其产物转化至大肠杆菌DH5a后扩增，再用AvrII和EcoRI酶切和测定序列检查ScFvA7基因

2、插入的准确性.［结果］构建pHC9K_ScFvA7重组载体，经序列测定检查核苷酸序列正确，且ScFvA7基因准确地克隆至载体开放读码框架内.［结论］成功地构建了抗乙酰胆碱受体主要免疫原区单链抗体A7基因的真核表迗载体.【关键词】重症肌无力；抗体；真核表迗载体ABSTRACT:OBJECTIVEToconstructarecombinanteukaryoicexpressionveinvariablefragmentagainstthemainimmunogenicregion(MIRceptor(AChR)forthectorofthesinglech

3、a(ScFv)A7ofantibody)ofacetylcholinerefurthereukaryoicexpressionandthegenetherapyinmyastheniagravis(MG).METHODSTheScFvA7genewasamplifiedbyPCRfromtherecombinantprokaryoticexpressionvectorpHEN2-ScFvA7,thenpurifiedanddigestedwithEcoRIandAvrII.Thedigestedproductswererunin1owme11ingpo

4、intagarosegeleletrophoresisandpurifiedbyWizardPCRPrepsDNAPurificationSystem,thenligatedintoeukaryoticexpressionvectorpPIC9Kdigestedandpurifiedbythesamemethod.TherecombinantvectorpPIC9K_ScFvA7wastransformedintoE.coliDH5aforamp1ificationandisolatedanddigestedwithAvrIIandEcoRIagain

5、.ThepPIC9K_ScFvA7genewasanalysedforaninsertoftherightsizebydigestionwithAvrIIandEcoRI.RESULTSThesequencingshowedthatthenucleotidesequenceofconstructedScFvA7wascorrectandclonedintotheopenreadingframe(ORF)inpPIC9K.CONCLUSIONTherecombinanteukaryoicexpressionvectorpPIC9K-ScFvA7hashe

6、ensuccessfullyconstructed.Keywords:myastheniagravis；antibodies；eukaryoticexpressionvector重症肌无力是抗乙酰胆碱受体抗体介导的器官特异性自身免疫病，AchR是由a20YS等5个同源亚单位组成的跨膜糖蛋白［1］.现已发现，重症肌无力患者血清中2/3的抗AchR抗体针对的是a亚单位的主要免疫原区的第67〜76位氨基酸表位［2］.当致病性抗体与神经肌肉接头处突触后膜上相邻2个AchRa亚单位上的主要免疫原区结合后，通过抗原调变或激活补体作用使突触后膜损伤［3］，AchR数

7、量减少，结果出现受累肌肉收缩无力及麻痹症状［4］.由抗AchR抗体制备的单链抗体作为单价片段，只能与1个a亚单位上的主要免疫原区结合，不引起抗原调变作用，且单链抗体无可结晶片段，不能激活补体导致AchR损伤.但单链抗体与主要免疫原区结合后，可特异性地封闭抗AchR抗体的结合位点，从而对AchR起到保护作用.本实验将构建在原核表迖载体克隆至真PHEN2上的抗AchR主要免疫原区单链抗体A7基核表达载体PPIC9K上，构建了重组真核表达载体.1材料与方法菌种与载体肠杆菌DH5a由荷兰马斯特里赫特大学医学院神经学系神经免疫学实验室提供，载体质粒pPIC9K由

8、军事医学科学院输血研究所章金刚教授惠赠，大肠杆菌HB2151由本实验室构建.试剂WizardP