全人源抗肝癌噬菌体单链抗体库的构建与筛选鉴定

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1、ResearchPapers研究报告生物化学与生物物理进展ProgressinBiochemistryandBiophysics2008,35(8):947~953www.pibb.ac.cn全人源抗肝癌噬菌体单链抗体库的构建与筛选鉴定*肖艳李官成**李跃辉黄建童永清张志杰(中南大学湘雅医学院肿瘤研究所，长沙410078)摘要体外致敏并用EBV转化肝癌患者的PBMC.用PCR分别扩增VH和VL基因并组成ScFv基因.将ScFv基因与载体fuse5连接后，电击转化大肠杆菌MC1061，构建噬菌体呈现型ScFv库.用人肝癌细胞及人肝细胞对初级噬菌体

2、抗体库进行亲和富集及phage-ELISA筛选.筛选获得的阳性克隆进行ELISA及免疫组化鉴定并测序.结果表明，经EBV转化的4例肝癌患者PBMC，ELISA检测均有抗肝癌抗体产生，经多次PCR，扩增出6种VH(γ、μ)和9种VL(κ、λ)基因，经连接组成54种ScFv基因.将ScFv基因与载体连接后，导入大肠杆菌MC1061，得到库容为1.0×108的初级噬菌体抗体库，全长ScFv基因的插入率为80%.用人肝癌细胞系HepG2和人肝细胞系QSG-7701对抗体库进行三轮正负淘选和富集后，从中随机挑取533个克隆进行ELISA筛选，得到179个

3、阳性克隆，阳性率为33.6%.将179个阳性克隆进一步进行其他细胞系的鉴定，发现克隆A82对肝癌细胞系HepG2、人胚肾上皮细胞系HEK293呈强阳性反应，免疫组织化学结果显示与人肝细胞癌组织有特异性反应，而不与正常肝组织反应.且A82的相对亲和力为2.4mol/L，解离常数K为5.32×10-9mol/L，显示其亲和力d较高.对克隆A82进行测序分析，结果表明：A82全长742bp，含linkercDNA序列45bp，重链可变区基因与人胚系IgVH3-23有94.3%的同源性，轻链可变区基因与人胚系IgV4-2有94.9%的同源性，V-D-J

4、分别属于VH3-23-D2-21-JH6-linker-V4-2-JL2.由上述结果可见，应用体外抗原致敏方法和EBV转化技术联合噬菌体抗体库技术，构建了库容量达1×108的全人源抗肝癌单链抗体库，通过细胞ELISA和免疫细胞化学鉴定，获得的噬菌体抗体克隆A82具有较强的特异性，为肝癌的临床诊断及导向治疗奠定了基础.关键词EB病毒转化，噬菌体抗体库，肝癌，单链抗体学科分类号R739.63肝癌是一种恶性程度极高的肿瘤，其治疗仍以手术切除为首选，但复发率极高，加上肝癌早期多1材料和方法无临床症状，绝大部分发现时已属于中晚期，丧失1.1材料了手术时机

5、，化疗药物应用于人体又会导致很大的丝状噬菌体FUSE5，K802、MC1061大肠肝副作用.单克隆抗体以其特异靶向性在临床放射免菌菌株均由本室保存.绒猴淋巴母细胞系B95.8，疫诊断和导向治疗方面有较大的应用价值[1,2]，但肝癌细胞株HepG2，鼻咽癌细胞系CNE2，大肠癌也存在诸多缺陷，制约了其在临床的应用.ScFv细胞系HRT-18，宫颈癌细胞系Caski，肺癌细胞弥补了传统单克隆抗体(mAb)制备繁琐、抗原性系A549，及人类正常细胞肝细胞系QSG-7701，人强、穿透力弱等不足，可望成为肝癌放射免疫诊断胚肾上皮细胞系HEK293，骨髓

6、间质干细胞和导向治疗的有力工具.本研究拟解决鼠源性单抗HBMSC，原代培养的脐静脉内皮细胞HUVEC等用于导向治疗穿透力低及易产生人抗鼠抗体反应等难题，采用体外致敏法和EBV转化技术联合噬菌*湖南省卫生厅科研基金重点项目(A2003001).体展示技术构建全人源的抗肝癌ScFv库，并进一**通讯联系人.步筛选获得高亲和力的抗肝癌ScFv，为肝癌的临Tel:0731-4805445,Email:libsun@public.cs.hn.cn床诊断及导向治疗奠定基础.收稿日期：2008-03-29，接受日期：2008-05-29·948·生物化学与生

7、物物理进展Prog.Biochem.Biophys.2008;35(8)均由本室保存.胎牛血清(FCS)及小牛血清(NBS)为1.2.5VH和VL基因的PCR扩增与连接.按文献杭州四季青公司产品.rhIL-2、谷氨酰胺、丙酮酸[3]设计合成扩增人抗体基因的引物.以cDNA第钠及环孢菌素A均为Sigma公司产品.一链为模板，在TaqDNA酶作用下，进行PCR扩RPMI1640、琼脂糖和细菌培养基，均购自Gibco/增VH和VL基因.并通过编码连接肽(Gly4Ser)3使BRL公司.TRIzol为Invitrogen公司产品.cDNAVH和VL基因

8、连成ScFv基因.回收PCR产物并合成试剂盒为Fermentas公司产品.PCR产物纯化测定其浓度.试剂盒，小量质粒抽提试剂盒购自长沙赢润生物技1.2