全人源抗肝癌噬菌体单链抗体的筛选与鉴定

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1、全人源抗肝癌噬菌体单链抗体的筛选与鉴定：黄建,肖艳,童永清,郭锋杰,周国华,李跃辉,胡锦跃,李官成【摘要】　　目的:构建人源抗肝癌噬菌体单链抗体库,从中筛选抗肝癌单链抗体（scFv）,并对其特异性进行鉴定。方法:采用体外致敏法和EBV转化技术联合噬菌体展示技术构建噬菌体抗体库。对初级抗体库进行亲和富集及ELISA筛选,获得的阳性克隆进行免疫组化鉴定并测序。结果:scFv基因与载体连接后得到库容量为1.0×108的初级噬菌体抗体库。对抗体库进行3轮正负淘选和富集后,随机挑取2798个克隆进行ELISA,发现3个克隆对HepG2呈强阳性反应,而与QSG7701等人正常细胞系呈弱阳性或不反应。对

2、克隆SA3进行免疫细胞化学鉴定,结果与ELISA一致。免疫组织化学鉴定表明SA3与肝癌组织和肝组织阳性率的差别有统计学意义。结论:构建了库容量达1×108的全人源抗肝癌噬菌体抗体库。通过淘选富集、ELISA和免疫组织化学鉴定获得特异性较强的噬菌体克隆,为肝癌的临床诊断及导向治疗奠定了基础。【关键词】EB病毒转化噬菌体抗体库肝肿瘤单链抗体　　[Abstract]AIM:Toconstructafullyhumanantihepatomasinglechainphageantibodylibrary,selecttheantihepatomascFvfromitandidentifyits

3、characteristics.METHODS:AfullyhumanscFvdisplayingphagelibrarymunizationandEBVtransformation.Thelibraryentandthenitacarcinomacellsedbyimmunohistochemistry.RESULTS:AfterscFvgenesbeingclonedintovectorFuse5andtransformedintoE.coliMC1061viaelectroporation,aphageantibodylibrarycontaining1.0×108TU(transd

4、ucedunit)entandtestingbyELISA,3phageantibodyclonesreactingmorestronglytoHepG2thanQSG7701munohistochemistryilartothoseofELISA.SA3reactedspecificallytohepatomacellsinmosthumanhepatomatissuesectionsbutinfeannormallivertissuesections.Thedistinctionofpositiveratesisofagreatstatisticalsignificance.CONCL

5、USION:AfullyhumanantihepatomascFvfusionphagelibraryhasbeenconstructed.ELISAandimmunohistochemistryresultsconformSA3specificallybindacarcinomacells.ThescFvfragmentagainsthepatomamaybefurtherdevelopedandappliedinclinicaldiagnosisandtherapyoflivercancer.　　[Keymortalization;phageantibodylibrary;hepato

6、ma;scFv　　肝癌是一种恶性程度极高的肿瘤,是我国和亚洲地区的常见病和多发病,病死率居恶性肿瘤的第3位[1]。肝癌90%以上为原发性,发病隐匿,发现时多数已处于中晚期,丧失了手术时机。目前的化疗药物由于缺乏肝癌细胞特异性而具有明显的副作用。单克隆抗体（mAb）以其特异靶向性在放射免疫诊断和导向治疗方面有较大的应用价值,但其作为鼠源蛋白容易引起机体排斥反应,限制了它的临床应用。噬菌体抗体库技术的出现并发展成熟使获得人源小分子抗体成为可能[2],它克服了mAb制备时效率低、杂交瘤体外培养不稳定等缺点,便于筛选针对多种抗原的抗体,而且可以直接获得抗体的基因序列,可以方便的通过基因工程手段进行改

7、造并大量生产。为提高筛选到特异性抗体的几率,我们实验室创立了体外致敏和EBV(EpsteinBarrvirus,EBV)转化技术联合噬菌体展示技术构建全人源噬菌体抗体库的技术[3,4],并筛选到了特异性抗体。本研究我们即从利用此方法构建的抗肝癌人源单链抗体库中筛选出抗肝癌细胞单链抗体(scFv),为肝癌的诊断和治疗奠定基础。　　1材料和方法　　1.1材料丝状噬菌体Fuse5,大肠杆菌菌株K91Kan,肝癌细