抗il-13全人源单链抗体的筛选 可溶性表达及鉴定

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1、达：以生物素化lL一13蛋白为抗原，对前期构建的天然抗体文库利用噬菌体展示技术进行3轮富集，通过ELISA检测有30％的scFv与IL-13有结合性；将得到的阳性克隆子与IL．4，TSLP通过ELISA检测特异性，结果显示有一些单克隆子与lL．4，TSLP不结合，即不显色，说明此单克隆子有较好的特异性，与其他细胞因子交叉反应较低。挑选14个OD值较高的抗

2、L-13．scFv阳性克隆子进行PCR扩增，用BstNI酶切方法对其进行指纹图分析，将指纹图谱不同的克隆子送去测序。结果显示在单链抗体氨基酸序列中出现了琥珀终

3、止密码子，位于第32位氨基酸处。对琥珀密码子进行校正，利用单点突变的方法突变终止密码子中的一对碱基后变为氨基酸TrP(w)。将校正后的基因双酶切后与原核分泌性表达载体LZl6连接，构建重组表达载体IL-13．scFv／Lzl6，并转入大肠杆菌DH5aF’进行测序，测序正确后进行蛋白表达和纯化。对单链抗体进行表达及纯化，结果显示scFv在大肠杆菌DH5aF’中主要集中分泌在细胞周质间可溶性表达，抗体具备生物学活性，SDS．PAGE电泳显示纯化后的抗IL-13一scFv蛋白分子量大小为26KDa左右。(3)抗lL．

4、13全人源单链抗体特性分析：WesternBlot结果表明有显色，且条带唯一，即纯化得到的蛋白为抗IL-13一scFv。竞争ELISA结果显示：IL．13Ral和筛选的单链抗体可竞争性的与IL-13结合，说明IL．13Ral与单链抗体作用于IL-13的相同抗原表位，可有效的封阻IL一13／IL-13Ral的信号通路具有生物学功能。大分子相互作用实验(Blitz)结果显示抗IL．13全人源单链抗体与相应抗原IL一13反应较好且得到亲和力KD值为10～，可见筛选得到抗lL-13全人源单链抗体有较好亲和力；结论：成功

5、筛选到具有体外中和活性、亲和力相对较高、特异性较好的抗IL-13单链抗体。关键词：IL．13；全人源单链抗体；噬菌体展示万方数据Selection，solubleexpressionandidentificationoffullhumanscFvsagainstIL一13Abstract：bjective：Sincethe1980s，withmatureoftherecombinantDNAtechnology，wewidelyuseitsinmolecularbiologyandtransformgeneti

6、cstructureofantibodys，technologyofantibodypreparationdevelopedfromapolyclonalantibody,amonoclonalantibodytogeneticallyengineeredantibody·Withthecontinuousdevelopmentofpreparationforvariousantibodytechnologyinrecentyears，，geneticallyengineeredantibodyhasexper

7、iencedFabfragment，scFvantibodies，fullyhumanantibodies，whichhasasmallmolecularweight，penetrmingstrong，itdoesnotbindtoFcreceptors，easycharacteristicsofoperation，becomegeneticallyengineeredantibodyresearchfocus．Bronchialasthmaisacomplexdiseasecausedbyacombinati

8、onofmultiplegeneticandenvironmentalfactors．therehasbeennosuccessfulattempttotargetanyspecificgeneticfactorstotreatbronchialasthma·Accordingtothepathogenesisofasthmafromanewlydiscoveredinmolecularbasisofimmunology，molecularpathophysiology，andtargetedtoresearc

9、hbettercompliance，fewersideeffects，patientscanimproveatopicdiathesisdrugs．bothinmouseandhuman，raisesthepossibilitythatinhibitionofThelper(Th)．2cytokinessuchasinterleukin(IL)-4，IL一5，andIL-13could