抗胸腺基质淋巴细胞生成素（tslp）全人源单链抗体的筛选及特性分析

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1、抗胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)全人源单链抗体的筛选及特性分析院（系)、所基础疾学院研究生姓名失建光学科、专业民学免疮学导师姓名袁青教椅二0—五年三月1四川医科大学硕士学位论文目录1抗胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)全人源单链抗体的筛选及特性分析…………………………………………………12中文摘要…………………………………………………………13英文摘要…………………………………………………………44前言………………………………………………………………75实验材料……………………………………………………

2、……96实验方法………………………………………………………186.1TSLP抗原的表达纯化及鉴定………………………………….196.2抗TSLP全人源单链抗体的筛选及表达鉴定………………256.3抗TSLP全人源单链抗体的特性分析…………………………337结果……………………………………………………………358讨论……………………………………………………………509结论……………………………………………………………5310参考文献………………………………………………………5411英汉缩略词对照表……………

3、………………………………5912致谢……………………………………………………………6013TSLP与过敏性炎症反应的研究进展（综述）…………………612四川医科大学硕士学位论文抗胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)全人源单链抗体的筛选及特性分析摘要目的：抗体针对相应抗原具有高度的特异性和亲和性，使抗体在疾病的诊断和治疗中显示出了其他类型药物无可比拟的优势。抗体药物经历了多克隆抗体、单克隆抗体、基因工程抗体三个阶段。多克隆抗体来自于B细胞产生的抗体混合物，亲和力相对较高但特异性不好；单克隆抗体来自于单个B细胞

4、，特异性强纯度高但多为鼠源性抗体，对于人体存在排斥反应；基因工程抗体又称重组抗体，是利用重组DNA及蛋白质工程技术对编码抗体的基因按不同需要进行改造和重组而制备的抗体，目前基因工程抗体主要包括有嵌合抗体、人源化抗体、全人源抗体等。近年，抗体药物向低抗原性、高特异性方向发展，利用体外筛选技术筛选全人源抗体成为抗体药物主要发展趋势。人胸腺基质淋巴细胞生成素(thymicstromallymphopoietin，TSLP)是一种新型的、与白细胞介素-7（IL-7）类似的细胞因子，当过敏性炎症发生时其在皮肤角质形

5、成细胞和气道上皮细胞高度表达，能强烈刺激髓系树突状细胞(Den-driticcell，DC)介导的Th2型炎症反应发生。在全基因组相关研究中，发现TSLP基因是一种与易患过敏性[1][2-4]疾病相关的位点之一。在小鼠、灵长类动物实验模型中，已证实TSLP是诱导Th2型过敏性炎症疾病的关键启动因子。鉴于TSLP在过敏性疾病中发生的重要作用，本研究通过噬菌体展示技术从天然噬菌体抗体文库中筛选抗TSLP全人源单链抗体，并对筛选的单链抗体进行特性分析，为过3四川医科大学硕士学位论文敏性炎症疾病提供新的治疗途径。

6、方法：扩增TSLPcDNA，将目的基因与表达载体pET101/D-TOPO连接，转化大肠杆菌BL21，IPTG诱导表达并对表达产物进行纯化鉴定。以生物素化TSLP蛋白为抗原利用噬菌体展示技术对前期构建的天然抗体文库进行3轮富集，用ELISA检测技术从富集的单链抗体文库中筛选抗TSLP全人源单链抗体（scFv）。用BstNI酶切方法对筛选抗TLSP-scFv阳性克隆子进行指纹图谱分析；将指纹图谱不同的克隆子连接LZ16载体，转化大肠杆菌BL21后进行表达纯化，用Dotblot及Westernblot方法对表

7、达纯化的抗TLSP-scFv蛋白进行鉴定；用间接非竞争ELISA分析纯化后抗TLSP-scFv抗体效价；用竞争ELISA方法检测scFv和TSLP受体与TSLP的竞争结合，分析scFv与TLSP受体是否作用于TSLP的同一抗原表位，从而达到封阻TSLP与受体结合的功能；用大分子相互作用分析技术对抗TSLP全人单链抗体进行特异性及亲和力分析。结果：①.TSLP抗原的表达纯化及鉴定：对TSLP基因的开放阅读框（ORF）进行了PCR扩增，扩增的TSLPcDNA片段大小为423bp左右；将cDNA与pET101/

8、D-TOPO连接，转化BL21进行表达，表达的TSLP蛋白大小为26KDa左右；Dotblot及Westernblot鉴定显示表达的蛋白正确，为TSLP目的蛋白。②.抗TSLP全人源单链抗体筛选与表达：以生物素化TSLP蛋白为抗原，采用噬菌体展示技术对全人源抗体文库进行3轮富集，通过ELISA检测有35%的scFv与TSLP有结合特性；将与TSLP结合能力强的单链抗体基因与原核分泌性表达载体LZ16相连接，构建重组表达载体sc