抗tnf_单链抗体噬菌体展示文库的建立和鉴定

《抗tnf_单链抗体噬菌体展示文库的建立和鉴定》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、ISSN1007-7626中国生物化学与分子生物学报2010年10月CN11-3870/QChineseJournalofBiochemistryandMolecularBiology26(10):930～936抗TNF-α单链抗体噬菌体展示文库的建立和鉴定1)2)1)1)1)1)，3)*杨涛，柴蔚然，杨利军，程牛亮，解军，牛勃1)(山西医科大学生物化学与分子生物学教研室，省部共建细胞生理学教育部重点实验室，太原030001;2)3)上海交通大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室，上海200025;首都儿科研究所，北京100020)摘要应用噬菌体展示技

2、术构建抗肿瘤坏死因子α(tumornecrosisfactorα，TNF-α)单链抗体(singlechainFv，scFv)文库，从中筛选抗TNF-αscFv并进行鉴定.利用重组人TNF-α(rhTNF-α)免疫小鼠，分别扩增小鼠VH和VL基因，经重叠延伸反应将VH和VL基因拼接成scFv基因，以Sfi8Ⅰ/NotⅠ位点定向插入pCANTAB5E噬菌粒载体，转化E.coliTG1，构建了库容为4.6×10的抗TNF-α单链抗体库.对抗体库进行3轮富集筛选后，ELISA检测阳性克隆的抗原特异性，取1株阳性克隆进行测序分析.结果表明，抗TNF-αscFv基

3、因序列长774bp，编码258个氨基酸.将此阳性克隆转化E.coliHB2151，IPTG诱导可溶性scFv的表达，经SDS-PAGE和Western印迹分析，scFv的分子量约为28kD.经亲和纯化后的scFv可与rhTNF-α结合，并可中和由rhTNF-α引起的L929细胞毒性.本文利用噬菌体抗体库筛选到了高亲和力的抗TNF-αscFv，为研制临床免疫治疗的新型抗体奠定了实验基础.关键词噬菌体展示技术;肿瘤坏死因子-α;单链抗体中图分类号R392ConstructionandCharacterizationofSingleChainFvPhageDi

4、splayLibraryAgainstTumorNecrosisFactorα1)2)1)1)1)1)，3)*YANGTao，CHAIWei-Ran，YANGLi-Jun，CHENGNiu-Liang，XIEJun，NIUBo1)(DepartmentofBiochemistryandMolecularBiology;KeyLaboratoryofCellularPhysiology，ShanxiMedicalUniversity，2)MinistryofEducation，Taiyuan030001，China;DepartmentofBiochemi

5、stryandMolecularBiology，BasicMedicalCollege，3)ShanghaiJiaotongUniversity，Shanghai200025，China;CapitalInstituteofPaediatrics，Beijing100020，China)AbstractThisstudywastoconstructsinglechainFv(scFv)libraryagainsttumornecrosisfactorα(TNF-α)byphagedisplaytechniqueandtocharacterizethean

6、ti-TNF-αscFvclonesselectedfromthelibrary.TotalRNAwasextractedfromthesplenocytesoftheBALB/cmiceimmunizedwithrecombinanthumanTNF-α(rhTNF-α).ComplementaryDNAfragmentsofvariableheavy(V)andvariablelightH(V)chainsofantibodieswerepreparedbyRT-PCRandassembledintoscFvwithaflexiblepeptideL

7、linker(GlySer).ScFvfragmentwasinsertedintothephagemidvectorpCANTAB5EthroughSfiⅠ/34NotⅠsites.ThephagemidescontainingscFvcDNAweretransformedintoE.coliTG1bacterialcellsto8generatescFvantibodylibrarywithadiversityofapproximately4.6×10.Threeroundsofenrichmentandpanningwereperformedtos

8、electspecificanti-TNF-αscFvfromthelibrar