重组人TNFα免疫小鼠全套单链抗体噬菌体表面展示文库的构建

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1、山西医科大学硕士学位论文重组人TNF-α免疫小鼠全套单链抗体噬菌体表面展示文库的构建姓名：柴蔚然申请学位级别：硕士专业：生物化学与分子生物学指导教师：程牛亮;牛勃2003.5.20坐至墨坠兰些笙笙丝兰———————竺鎏些鳖摘要目的应用噬菌体展示技术构建抗重组人肿瘤坏死因子a(rhTNF—a)的单链抗体库。为研究人I'TNF．a受体结合位点，了解结构与功能的关系奠定基础，同时也为临床免疫治疗提供一种经济有效的新型抗体打下基础。方法利用噬菌体表面展示技术，绕过杂交瘤技术，用rhTNF氓同时加入福氏佐剂，免疫BALB／C小鼠，取其脾脏，分离淋巴细胞，提取细胞总RNA，逆转

2、录成cDNA第一条链，以该链为模板，用相应引物扩增小鼠免疫球蛋白VII基因和VL基因，构建VII、VL抗体库。由Linker-primermix经重叠延伸反应将重链可变区基因与轻链可变区基因拼接成单链抗体(ScFv)。再用RSprimermix以ScFv为模板进行第二次PCR，同时在57端及3’端分别加上SfiI、NotI酶切位点，从而获得全套抗rhTNF．a的ScFv基因。以SfiI／NotI位点定向插入pCANTAB．5E噬菌粒载体，用氯化钙法转化大肠杆菌TGI，然后经M13K07辅助噬菌体拯救，构建成全套抗rhn晒．aScFv表面展示文库。结果1．从北京海军总

3、医院购买的rhTNF—a，经SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳后，考马斯亮蓝染色仅见目的条带，已达到电泳纯。以该蛋白来免疫小鼠，并用闻接ELISA法检测血清中抗体效价可达10～．104之间。符合构建抗体库的要求。2．经RT-PCR扩增出重链、轻链可变区基因片段，经1．5％琼脂糖凝胶电泳，可清楚地看到340bp左右和325bp左右处有DNA条带即为山西医科大学生物化学与分子生物学2003届硕士学位论文扩增的VII与vLDNA片段，与预期的片段大小相符。3．将重链、轻链可变区基因通过Linkerprimermix拼接后，用RSprimermix进行第二次PCR，经1．5％琼脂糖

4、凝胶电泳，可清楚地看到一片段大小约750bp左右的DNA片段。此DNA片段以SfiI／NotI位点定向插入pCANTAB一5E噬菌粒载体的gpⅢ基因前方。氯化钙法转化大肠杆菌TGl，构建抗rhTNF．旺抗体可变区基因文库。4．成功构建了噬菌体抗体库，经计算库容量约为4．6X106。经M13K07超感染后，测噬菌斑滴度为2．1×10¨pfu．L一。结论本课题从提取免疫小鼠脾脏淋巴细胞的总RNA出发，运用RT-PCR、重叠延伸反应以及DNA重组技术等，获得了抗rhTNF．Ⅱ抗体的可变区VII、VL基因，成功地构建了全套抗rhTNF．aScFv噬菌体表面展示文库。该文库为

5、利用亲和富集筛选技术，获得具有TNF．a结合活性的完整重组噬菌粒克隆奠定了基础。同时也为进一步的基因工程抗体研究及抗原一抗体相互作用机理的阐明打下基础。关键词TNF—Q单链抗体噬菌体表面展示技术抗体-____________-_-__-ll_-__-●●________________--________●__●————————一一Constructionofaphagedisplaylibraryofrepertoiresingle．chainFvantibodiesfrommouseimmunizedwithrecombinanthumantumornecros

6、isfactora(TNF—a)AbstractPurposeThroughgeneengineeringtechnique，toconstructthephagedisplaylibraryofsingle—chainantiboayobtainedfrommouseimmunizedwithrecombinanthumantumornecrosisfactor—u(rhTNF·Ⅱ)，whichwilldramaticallydecreasetheimmtmogenicofmonoclonalantibodyoriginatedfrommouse．Toresolv

7、etheproblemofthesourceandthepriceofantibodyandobtainmorestableandhigh-qualityantibodyfortreatmentpurpose．TostlldythereceptorbindingsiteofhumanrhTNF·口andtherelationshipbetweenitsstructureanditsfunctionatadvantageoftheneutralizationcharacteristicofmonoclonalantibody．Toexploreanewmethod