人源性胃癌抗体igg1fab噬菌体表面展示文库的构建论文

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1、人源性胃癌抗体IgG1Fab噬菌体表面展示文库的构建论文.freelachneoplasms;antibodies，neoplasms;bac-teriophagesAbstract:AIMToconstructaphagedisplaylibraryofhu-manIgG1Fabantibodiesfromlymphnodesofgastriccancerpatientsusingphagedisplaytechnique.METHODSTotalRNAlymphnodesofgastriccancerpa-tients.Fdfragmentandkappalight-chai

2、nplifiedbyRT-PCRandclonedintothephagemidpB3andex-pressedasafusionproteinanIgG1FabantibodiesanIgG1Fabantibody.0引言单克隆抗体的出现使肿瘤抗体介导的免疫治疗发生了突破性进展.然而，目前所用的抗体多为动物源性抗体，用于人体会产生异源性抗体反应，影响效果，限制了免疫治疗的发展.使用人源性抗体则可避免异源性抗体反应.但是，用传统方法制备人源性抗体十分困难，1990年代初建立的噬菌体表面展示抗体库技术为制备人源性抗体开辟了一条快捷途径，促进了人源性抗体的发展.我们利用噬菌体表面展示

3、抗体库技术，从胃癌手术患者一级站淋巴结中提取总RNA，构建了胃癌人源性抗体IgG1Fab段的噬菌体表面展示文库，为下一步利用亲和富集筛选技术，获得具有胃癌表面抗原结合活性的融合抗体及可溶性抗体奠定了基础.1材料和方法1.1材料淋巴结标本采自西京医院胃肠外科，经病理诊断为胃癌病例的一级站引流淋巴结.宿主菌株E.coliXL1-blue由本室保存，含有F’因子，携带四环素抗性基因（Tetr）.噬菌粒载体pB3含有氨苄青霉素抗性基因（Ampr），LacZ启动子及噬菌体间隔片段和用于克隆Fd段的SpeI，XhoI克隆位点及用于克隆轻链的XbaI，SacI克隆位点.辅助噬菌体M13K07，

4、为Phamasia公司产品，带有突变型基因Ⅱ，复制起始位点和卡那霉素抗性基因（Kanr）.RNA提取试剂、限制性核酸内切酶、T4DNA连接酶、DNA纯化试剂盒分别为Promega公司、华美生物制品公司产品，cDNA反转录试剂盒为MBI公司产品.TaqDNA聚合酶和dNTPs为Promega公司产品.引物由上海生工生物制品公司合成，序列参照文献［1］设计，引物浓度为50pmolL-1.其中P1，P2为Fd段5’端引物，P3为Fd段3’端引物;P4，P5为轻链5’端引物，P6为轻链3’端引物.1.2方法1.2.1Fd段和κ轻链基因的扩增参照文献［2］进行，略有改动.将淋巴结研碎，采用

5、异硫氰酸胍一步法［3］提取总RNA.经紫外分光测量鉴定纯度.反转录合成cDNA按照试剂盒说明操作.反转录合成的第一条链作为扩增的模板与上下游引物混合，在50μL反应体系中进行反应:95℃5min，94℃1min，62℃1.5min，72℃2min，11次循环;94℃1min，58℃1.5min，72℃2min，11次循环;94℃1min，54℃1.5min，72℃2min，15次循环;72℃8min.PCR产物经20gL-1琼脂糖凝胶电泳，用Mi-crospincolumns纯化回收目的基因片段.1.2.2Fd噬菌粒文库的构建参照文献［4］进行.用限制性核酸内切酶SpeI，Xho

6、I酶切Fd片段和噬菌粒载体pB3，于16℃连接20h，同时作线性pB3自连对照.用TSS法将连接产物转化入E.coliXL1-Blue，转化产物培养1h后全部均匀涂布在LB固体培养基上（含Amp100mgL-1），18h后计算总克隆生成数，代表初始文库库容量.用碱裂解法［5］提取重组噬菌粒pB3-Fd，酶切鉴定噬菌粒.1.2.3Fab噬菌粒文库的构建用限制性核酸内切酶SacI，XbaI酶切κ轻链片段和pB3-Fd噬菌粒，按上述方法连接、转化，并于固体培养基上培养，计算总克隆生成数.随机挑取10个分隔良好的单克隆，提取噬菌粒酶切鉴定.1.2.4IgG1Fab片段的噬菌体表面展示及文

7、库滴度测定取部分含pB3-Fab噬菌粒的菌液，用2×YT培养液（含Amp100mgL-1，2gL-1葡萄糖）50mL稀释至A600nm为0.3，培养至A600nm=0.6时，加入8.5×1010pfu的辅助噬菌体M13K07，静置10min后振摇培养1h.再离心弃上清，将细菌沉淀重悬于50mL2×YT培养液（含Amp100mgL-1，Kan70mgL-1）中，37℃快速振摇培养过夜.离心并收集上清即为IgG1Fab片段的噬菌体表面展示文库.将所得文库分别作10-8，10-10，1