天然的人源性核糖体展示抗体库的构建与初步鉴定.doc

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1、天然的人源性核糖体展示抗体库的构建与初步鉴定【摘要】目的构建库容量大、多样性好的核糖体展示单链抗体；TaqDNA聚合酶，T4DNA连接酶，兔网织红细胞裂解液，T7RNA聚合酶，rNTPsRNaseinhibitor；pMD18TVector载体；RNA抽提试剂盒；脂多糖。方法mRNA提取和RTPCR抽取10位健康志愿者外周血，其中男性5例，女性5例，用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞。按mRNA提取试剂盒(Amersham)说明书所述步骤提取mRNA。以Oligo(dT)为引物逆转录合成第一链cDNA,具体方法按说明书进行。ScFvDNA的构建及扩增利用mR

2、NA反转录合成cDNA第1链，以第1链为模板，扩增抗体基因按文献扩增人类主要的轻重链可变区基因，所有引物序列根据抗体两端相对保守的框架区设计［23］。所需引物和寡核甘酸均由上海生工负责合成。扩增重链VH可变区引物为：VH/T7:5’GCAGCTAATACGACTCACTATAGGAACAGACCACCATGAGGTSMARCTGCAGSAGTCWGG3’VH2:5’TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGGCCCC3’其中划线部分为T7启动子序列；黑体部分所示为核糖体结合位点。扩增VL可变区引物为:VL:5’ATTGAGCTCACCCAG

3、TCTCCA3’Ck:5’GAACACTCATTCCTGTTGGAGCT3’引物中的简并碱基符号M-A/C,R-A/G,S-C/G,W:A/T，按程序1（30个循环：94°CXlmin->55°CX2min—72°CX2min）进行PCR,分别扩增VH和VLcDNA，对扩增产物进行纯化并测定其浓度。Linker序列为（Gly4Ser）3，该引物两端的各18个碱基分别与VH和VL基因的3’端和5’端相互补。将VH、VL和Linker等量混合后，经程序2（7个循环:94"CXlmin—63°CX4min）进行聚合反应使VH和VL籍linkerDNA连接形成

4、ScFvDNA。然后通过引物VH2和CK进行PCR扩增，执行程序1，使聚合的ScFvDNA得到扩增。核糖体展示抗体库的构建将最后纯化的核糖体ScFv展示模板连接TVector,用BioRad电转化仪将连接产物转化入JM109,通过蓝白筛选，随机挑取9个克隆子，进行菌落PCR法验证。将验证阳性的克隆子测序，分析序列，以此评价文库序列的多样性。核糖体展示抗体库的初步鉴定将PCR扩增的随机ScFvDNA文库进行离体转录，37°C反应2h，回收mRNA。转录产物再用兔网织红细胞裂解液系统进行离体翻译30°C培育30min，于冰上放置。将体外翻译完成的产物立即从

5、30QC拿出，加入冰冷的PBSMB溶液，轻轻混匀后，加入已用LPS封闭好预冷的酶联板中，每孔50uL，冰上放置1〜2h。用PBSTM冲洗3遍，每次5min，然后用PBSM冲洗2遍，每次5miri。加入EB缓冲液(1XPBS缓冲液中含20mmol/LEDTA)，冰上放置lOmin,吸取上清。重复此步骤1次。将收集的上清用RNA抽提试剂盒(Roche)提取上清中的RNA，引物VH/T7和Ck反转录扩增RNA得到一轮筛选后的ScFvDNA文库。将DNA文库又进行体外转录、翻译、筛选，重复2次。得到3次筛选后的ScFvDNA文库。分别以回收的RNA为模板进行R

6、TPCRo2结果VH、VL及ScFvDNA的扩增结果扩增得到的VH和VLDNA分别约为350bp和650bp，VH、VL和linker连接后的ScFv片段大小为kb左右。将大量扩增的ScFvDNA通过琼脂糖凝胶电泳回收纯化，保存于_20°C。核糖体展示ScFv文库的构建及分析将菌落PCR验证为阳性的9个克隆子测序。结果表明，克隆的9条ScFv序列都是完整的，为开放阅读框，内部没有终止密码子。通过VBASEDNAplot软件分析9条ScFv序列，其重链分别属于VH1，VH3,VH5,VH4基因家簇，轻链分别属于VKI，VKII,VKIII亚基因家簇。根据

7、Rabat软件分析，9条序列的重链和轻链CDRs也均有不同程度的变化。核糖体展示ScFv文库的初步鉴定将每轮回收得到的RNA各取2uL进行RTPCR扩增，扩增结果见图2。从中可以看出，第一轮筛选后回收的mRNA进行RTPCR扩增，得到一条非常微弱的条带。而经过3轮筛选后，得到非常明亮的扩增条带。3讨论RD是蛋白质筛选的重要工具，已用于筛选配体、受体，确定抗原表位，开发新的蛋白酶抑制物和新的药物等。该技术的特点是：正确折叠的完全蛋白和编码它的mRNA，同时结合在核糖体上，利用抗原抗体特异性结合的特点，便于蛋白富集，便于抗体文库筛选，是一种无细胞系统的蛋白

8、质改造技术，可分为真核和原核RD。真核系统较原核系统有一定的优越性，原核系统受内源RNase的