全长人源抗vegf抗体库构建及展示

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1、博士学位论文全长人源抗VEGF抗体库的构建及展示博士研究生：梁中锟指导教师：谭万龙教授周辰教授摘要肾癌是泌尿系统威胁人类健康的常见恶性肿瘤，对放疗、化疗均不敏感。由于肾癌起病隐匿，在诊断时有25"--30％已发生转移。而且，即使是局限性肾癌，采取根治术后仍有近30％患者会复发。针对这部分转移及复发肾癌的治疗是泌尿外科的难点和研究方向。随着研究深入，发现肾癌特别是透明细胞痛多存在VonHippel．Lindau(VHL)基因突变，乏氧诱导因子(hypoxia-induciblefactor,HIF)及血管内皮生长因子(vascularendoth

2、elialgrowthfactor,VEGF)表达增高，而且VEGF增高与肿瘤分期及预后密切相关。因此，抑制或阻断VHL．HIF．VEGF信号通路，特别是阻断VEGF或其受体VEGFR，就可能抑制肾癌的生长。贝伐单抗(Bevacizumab)是VEGF特异性的经过人源化改造的鼠源抗体，能特异性与VEGF结合并阻断其生物活性。贝伐单抗联合IFN．a可以提高转移性肾癌的客观缓解率(OI讯)和无疾病进展率(PFS)。2007年12月美国FDA批准贝伐单抗联合IFN．a作为靶向治疗转移性肾癌的一线治疗方案。然而，通过杂交瘤技术获得的单抗需经过人源化改造

3、，一方面不可能完全去除抗体的免疫原性，另一方面抗体窄间构型可能发生改变，亲和力往往会降低，很难达到预期的作用效果。为了尽可能减少药用抗体的免疫原性，研究者尝试利用哺乳动物细胞表面抗体展示技术用于人源抗体的筛选，但目前的这些哺乳动物细胞表面展示技术摘要所构建抗体库容量多局限于104～106，筛选抗体多样性不足，不能满足筛选高亲和力抗体的要求。为了克服哺乳动物细胞表面展示技术筛选全长人源抗体存在的上述不足，本课题组对现有的哺乳动物细胞展示技术作了技术改良。人的VEGF是一种自身蛋白，以来自于自身免疫病患者的外周血淋巴细胞为材料构建抗体库筛选到抗VE

4、GF抗体的几率更大。通过提取自身免疫病患者的外周血淋巴细胞的总RNA，进行RT-PCR扩增伞套抗体基因，随后使用哺乳动物细胞表达载体pDGB．HC．TM，构建了三个全长人源抗体基因库，库容量达到1010以上。将抗体基因库通过四片段连接插入哺乳动物细胞表达载体pDGB4，然后将其稳定转染FCHO细胞。由于采用基因定点整合技术，每个细胞只表达一种抗体，从而成功建成能展示全长抗体的哺乳动物细胞库。本课题通过全基因合成的方法合成了贝伐单抗的全长基因，并根据哺乳动物细胞对密码子的选择性对抗体基因的碱基序列进行表达优化，既作为筛选抗体的阳性对照，同时也用于

5、抗体的链置换筛选技术，以提高筛选VEGF特异性抗体的成功率；与已经构建好的三个抗体库基因进行链置换，构建了全长人源抗VEGF抗体库，并成功将其展示于哺乳动物细胞表面。。一、全长人源初级抗体库的构建及展示目的：构建大容量的全长人源初级抗体基因库。方法：1．外周血淋巴细胞的分离及总RNA的提取从供体中采集适量静脉血，置于肝素抗凝管中，采用密度梯度离心法分离外周血单核细胞，加入适量BufferRLT，裂解细胞，--80"12冰箱保存备用或者直接用于提取总RNA。2．eDNA第一链的合成以总RNA为模板，应用根据V-BASE网站信息所设计合成的全套人抗

6、体重玎博士学位论文链可变区引物和全套人抗体轻链恒定区引物，逆转录合成eDNA第一条链。3．全套IgGl重链可变区基因和轻链K型全长基因的扩增以合成的eDNA为模板，用相应的特异性引物扩增伞套IgGl轻链lc型全长基因及全套IgGl重链可变区基因(3套轻链引物，3套重链引物)。PCR条件为：94"(2预变性5分钟，然后进行35个循环的PCR扩增(94"C变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min)，随后在延长温度下反应7min，以确保全长目的片段的合成。PCR扩增产物的分离纯化用PCR扩增抗体全套Kappa轻链和重链可变区基因。PCR产物用

7、1％的琼脂糖凝胶电泳分离纯化目的片段。然后将回收得到的3组重链基因PCR扩增产物，再次经l％琼脂糖凝胶电泳后回收目的片段备用。并用同样方法处理3组轻链PCR扩增产物。重链抗体基因库及轻链基因库的构建及鉴定以BsmBI对重链基因扩增产物及载体pDGB．HC．TM进行酶切，电泳分离纯化目的片段，将回收的载体片段和抗体基因片段用T4DNA连接酶按l：l比例混合连接，在16℃反应24h后导入化学转化感受态大肠杆菌TOPO．10，构建重链基因库。’轻链全长基因的扩增产物经sJn酶切后回收，与同样经．驴I酶切回收的载体pDGB．HC．TM片段用T4DNA连

8、接酶按l：l比例混合连接，在16℃反应24h后导入化学转化感受态大肠杆菌TOPO．10，构建轻链基因库。分别从重链抗体库和轻链抗体库中各随机挑取10个