应用哺乳动物细胞表面抗体展示技术构建登革病毒特异性全长人源抗体库

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1、南方医科大学2013级硕士学位论文应用哺乳动物细胞表面抗体展示技术构建登革病毒特异性全长人源抗体库ConstructionofDeng‘pecificfullhLgthfully(SonstructionotDenguevirus-specific士ull-lenKthlyh。umanlantibodylibrariesbymammaliandisplaytechnology课题来源：广东省自然科学基金($2011010003912)杭州环捷科技有限公司科研基金南方医科大学公卫学院院长基金资助(GW201248)学位申请人导师姓名专业名称培养类型培养层

2、次所在学院温扬明曹虹教授周辰教授病原生物学学术型全日制硕士公共卫生与热带医学学院2013年5月31日广州硕士学位论文应用哺乳动物细胞表面抗体展示技术构建登革病毒特异性全长人源抗体库硕士研究生：温扬明指导老师：曹虹教授周辰教授摘要抗体(antibody)是人类免疫系统的重要组成部分，为机体提供有效的免疫防护。近二十年来，抗体在许多领域的应用越来越广泛，包括环境监测，临床检测及疾病治疗等。随着现代生物学技术的不断发展，所获得的单克隆抗体种类大大增加、临床应用的副作用有了显著改善。单克隆抗体制备技术出现于上世纪七十年代。通过杂交瘤技术获得的抗体是鼠源性的抗体

3、，用于临床治疗时会存在诱发人抗鼠抗体反应(humananti．mouseantibody，HAMA)的可能性，并且安全性较差。其应用价值在一段时间里一直备受讨论。随着现代生物学技术的不断发展，所获得的单克隆抗体种类大大增加、副作用有了显著改善。抗体越来越广泛的被利用，包括临床治疗及检测、环境监测等。单克隆抗体的制备技术先后经历了杂交瘤技术、抗体库技术、抗体展示及筛选技术等多个发展阶段。目前较为常用的噬菌体展示等技术，有着实验过程简单，库容量大等优点。但是由于噬菌体展示技术一般只能筛选抗原结合片段(Fragmentofantigenbinding，Fab

4、)或单链可变区抗体片段(singlechainvariableFragment，scFv)等小分子，所以不能通过噬菌体展示技术筛选得到全长的人源抗体；另外，展示系统所使用的宿主细胞为原核细胞，原核细胞在表达蛋白过程中的密码子与真核细胞不同，因此大噬菌体展示技术筛选获得的全长抗体很难在哺乳动物系统中获得高表达。而利用现有的哺乳动物细胞表面展示摘要技术所建立的全长抗体库的库容量仅为106，不足以满足筛选出高特异性抗体的需求；若能够提升抗体库的构建效率，建立大容量的哺乳动物细胞表面展示全长抗体库，将有利于从中筛选获得高特异性、高亲和力的抗体，从而推动抗体研究

5、的进步。登革病毒感染可引起登革热(DF)、登革出血热(DHF)和登革休克综合症(Dss)。DHF／DSS病情严重，致死率高。因为其感染机制较为复杂，目前尚未行之有效的临床针对性治疗。又因为其由蚊媒传播难以控制，同时缺乏有效的登革疫苗。因此，对筛选出高特异性的登革抗体，不仅是运用于临床治疗药物的开发还是用于疫苗的研制，都有非常重要的作用。甚至对其发病机理的发现，都将大有帮助。本研究使用课题组前期构建成功的哺乳动物细胞表达载体pDGB．HC．TM，通过将全长抗体基因插入载体中，再展示在哺乳动物CHO细胞表面，为以后筛选较理想高特异性登革抗体做铺垫。通过流式

6、分析得到的结果，8个轻链克隆、7个重链克隆均可检测到抗体的表达，细胞阳性率2．8％．41．3％，这与抗体库基因测序结果相一致。理论上获得的抗体多样性达到1．46×109[(1．45×104×80％)×(1．8x105×70％)]。从流式分析结果来看，在没有转染质粒的阴性对照组，CHO细胞背景阳性率只有0．2％，而转染有高效表达的载体阳性对照组，CHO细胞表达达到37．7％，这说明CHO细胞可以作为很好的展示平台。随后将轻链抗体基因和重链抗体基因同时插入到哺乳动物细胞表达载体pDGB4中，构建登革病毒全长人源二级抗体基因库，库容量为2．4x105，背景克

7、隆的比例为1．2％。将其瞬时转染CHO细胞，流式细胞仪检测发现，阳性组为12％，而本研究所建立的登革病毒全长人源二级抗体基因库中有最高有19％的细胞表面成功展示全长抗体并被检查到。II硕士学位论文一、登革病毒特异性全长人源抗体库的构建目的：应用哺乳动物细胞表面抗体展示技术构建登革病毒特异性全长人源抗体库方法：1．外周血淋巴细胞的分离及总RNA的提取采集确诊的登革热患者恢复期静脉血20ml，置于抗凝管中，采用密度梯度离心法分离外周血单核细胞，加入适量BufferRLT，裂解细胞，一80℃冰箱保存备用或者直接用于提取总RNA。2．eDNA第一链的合成以提取

8、的总RNA为模板，使用轻链全长引物和重链可变区引物，逆转录合成eDNA第一条链。3．全套IgG