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《快速构建哺乳动物细胞表面展示的全长人抗体基因库》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、·308·南方医科大学学报（JSouthMedUniv）2011;31(2)·基础研究·ॹܒࡹѿೄ༥Іі૫ᅚൕಆӉದॆุࠎၹ९123234516贺微，李长征，陈振瑞，周烨，谭万龙，姜世勃，周志刚，刘叔文，周辰1234南方医科大学药学院，基因工程研究所，南方医院，广东广州510515；纽约血液中心LFK研究所，纽约5610065美国；广州医学院第二附属医院，广东广州510260；香港Dgen生物技术有限公司，香港999077摘要：目的快速构建哺乳动物细胞表面展示的全长人抗体基因库。方法分离外周血淋巴细胞（PBMC），提取PBMC的总RNA，采用
2、RT-PCR的方法扩增抗体重链可变区（VH）和全长Kappa型轻链（LCκ）基因库，分别插入载体pDGB-HC-TM，化学转化感受态大肠杆菌DH5α，构建抗体的轻、重链基因库，然后将其联合转染CHO细胞，流式细胞仪分析全长人源抗体在CHO细胞表面的表达。结果构建的非特异性IgG1-Kappa抗体基因库，重链库容量达2.6×105，轻链库容量达2.0×105，理论库容量高达5.2×1010。随机从重链库和轻链库各挑选10个克隆送测序，重链10个克隆的DNA序列分析显示8个含有正确的阅读框架，轻链10个克隆的DNA序列分析显示全部含有正确的阅读框架。流
3、式细胞仪分析显示来自轻链库的10个克隆、重链库的8个克隆均可检测到抗体在CHO细胞表面的表达。用所构建的轻重链抗体库共转染CHO细胞，流式细胞仪分析可检测到抗体在细胞表面的表达，阳性细胞比例达到31.5%，说明所构建的抗体库能够在CHO细胞表面成功展示全长抗体。结论采用本研究建立的哺乳动物细胞展示技术，可在2周内成功构建库容量大且多样性好的全人源抗体基因库，用于高亲和力特异性抗体的筛选。关键词：快速构建；哺乳动物细胞展示；全长人源抗体库中图分类号：R737.11文献标志码：A文章编号：1673-4254（2011）02-0308-05Rapidco
4、nstructionofamammaliancellsurfacedisplaylibraryoffull-lengthhumanantibodiesHEWei1,LIChang-zheng2,CHENZhen-rui3,ZHOUYe2,TANWan-long3,JIANGShi-bo4,ZHOUZhi-gang5,LIUShu-wen1,ZHOUChen61SchoolofPharmaceuticalScience,2InstituteofGeneticEngineering,3NanfangHospital,SouthernMedicalUni
5、versity,Guangzhou510515,China;4LindsleyFKimballResearchInstitute,NewYorkBloodCenter,NewYork,USA;5SecondAffiliatedHospitalofGuangzhouMedicalCollege,Guangzhou510260,China;6HongkongDgenBiotechLimitedCompany,Hongkong999077,ChinaAbstract:ObjectiveToconstructamammaliancellsurfacedis
6、playlibraryoffull-lengthhumanantibodies.MethodsThetotalRNAwasisolatedfromhumanperipheralbloodmononuclearcells(PBMCs),andthegenesencodingtheheavychainvariableregionsandkappalightchains(VHandCκ)oftheantibodieswereamplifiedbyRT-PCR.TheamplifiedVHandCκgenesequenceswereseparatelyin
7、sertedintothevectorpDGB-HC-TM.TheligationmixturesweretransformedintocompetentE.coliDH5αcellstoconstructtheantibodylibraries,andthelibrarysizesanddiversitywereanalyzed.ThelibraryDNAsweretransfectedintoCHOcellsandtheexpressionofthefull-lengthhumanantibodiesonthesurfaceofCHOcells
8、wasanalyzedbyflowcytometry.ResultsTheheavychaingenelibrarycon
