快速的构建哺乳动物细胞表面展示全长人抗体基因库

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1、硕士学位论文快速构建哺乳动物表面展示的全长抗体人基因库硕士研究生：贺微指导老师：刘叔文教授周辰教授摘要研究背景：抗体在生物医学领域中应用极为广泛，其制备技术经历了多克隆抗血清一单克隆抗体—基因工程抗体三个发展阶段。自70年代德国学者Koehler和英国学者Milstein利用细胞融合技术首次成功地制备出单克隆抗体(McAb)以来，其在临诊断治疗及蛋白质提纯等方面的重要作用日益明显，取得的成果令人鼓舞。但动物源性McAb具有免疫原性，进入人体后会产生不同程度的人抗鼠抗体反应(HAMA)；对清除抗体的器官产生毒性作用；实体组织穿透力差；McAb为异种超敏抗

2、原，对以后注入的McAb失去保护作用，干扰MeAb合理分布；此外，McAb成本较高也是难以普及应用的原因之一。基因工程抗体(geneengineeredantibodies,GEAs)恰好可以弥补上述不足GEAs又称重组抗体(recombinantantibodies，Ras)，是指利用重组DNA及蛋白质工程技术对编码抗体的基因按人们不同需要进行加工改造和重新装配，经转染适当的受体细胞进行表达的抗体分子。GEAs的特点是低或无免疫原性、组织穿透力强、分子量小、成本低、可规模化生产等。1984年国外首次报道了人一鼠嵌合抗体(chimericantibod

3、y,CA)在骨髓瘤细胞中表达成功，以后又出现了各种形式的小分子抗体和抗体融合蛋白。90年代以来出现的噬菌体表面展示技中文摘要术，使基因工程抗体技术发展到一个崭新的阶段。噬菌体展示抗体库技术是目前制备人源性抗体的热门技术之一，通过反复几轮“吸附．洗脱一扩增”的筛选过程，可从大容量的噬菌体展示抗体库中获得能够结合特异性抗原的抗体。但噬菌体表面展示抗体库仅可展示抗体的Fab段或单链抗体(seFv)，因此无法直接筛选获得全长抗体；当获得抗体片段后，需要将其改造为全长抗体，而此过程中常存在丢失抗体特异性和亲和力的风险，另外，由于筛选过程应用的是细菌，一旦将筛选获

4、得的抗体基因转入哺乳动物细胞，往往不能表达或表达量很低，难以满足抗体药物研发的需要。近十几年来，采用哺乳动物细胞表面展示系统(mammaliandisplay)成为发展人源抗体的重要方向。哺乳动物细胞中蛋白质的折叠、分泌以及翻译后修饰等过程与人体的最为接近，且应用哺乳动物细胞表面展示系统可展示全长人源抗体。全抗体分子中Fc段介导所有重要的效应功能，包括补体激活和Fc受体介导。IgGl和IgG3具有很强的补体激活功能和依赖特异Fc受体的抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)。但由于目前此技术尚不成熟，全长抗体库构建效率低，库容量小，目前文献报道仅达到

5、106，难以满足高亲和力、特异性抗体的筛选需要。因此，如何提高建库效率，快速构建大容量的哺乳动物细胞表面展示抗体库是一个必须解决的问题。连接和转化效率是构建大容量抗体库的重要因素之一。虽然增加转化的次数也是增大库容的途径之一，但是通过此方法提高库容量，费时费力，使得大容量抗体库的构建难以广泛开展。电穿孔法是大肠杆菌实现高效转化的最有效方法，1嵋DNA连接产物可获得约1010个转座子。但是在建库过程中由于PCR扩增、半合成寡核苷酸的引入以及多步酶学反应等因素产生的重复克隆、无效克隆及克隆数的丢失、使实际库容要小得多，因此构建大容量抗体库必须对实验设计和实

6、验条件进行优化，提高单次连接和转化的效率及增加连接与转化的次数。首先高效连接是实现高效转化的重要条件，高效连接决定于载体的性质、限制性内切酶的酶切与连接效率、载体与目的基因的比例。合适的限制性内切ll硕士学位论文酶的选择和合理使用将大大提高连接效率。本研究通过应用一组特殊的限制性内切酶以及本实验室已经构建好适用于快速构建大容量基因库的真核表达载体，构建全长轻链和全长重链抗体基因库。其中，所应用的两种限制性内切酶(Sill、BsmBI)切割之后的末端均不会自我连接，只有当相匹配的两个末端结合的时候才形成互补而被连接，从而大大提高基因库构建中的连接转化效率

7、，减少了建库的工作量。抗体库技术为新型抗体的研制提供了新的途径。但能否从抗体库中获得预期的抗体受到许多因素的制约，包括抗体库库容、多样性、保存条件、扩增情况以及抗体库的筛选等。而这其中最重要的一步就是要尽量将所有的抗体基因扩增出来，设计并应用一套具有良好扩增效率的引物对于提高库容量，保持抗体库多样性具有重要影响。我们首先根据V-BASE网站的相应信息设计的26对针对抗体重链可变区基因的引物，以及针对抗体轻链(Kappa链)全长基因设计15对引物，应用上述引物在2个月的时间内成功构建的重链基因库和轻链基因库的容量在105"-一106，将重链库和轻链库共转

8、入哺乳动物细胞后，可以利用细胞本身的天然配对机制，使所展示抗体的多样性达到1010，但是由于引