全长人源膀胱癌抗体库的构建及双表达载体pdgb4的构建

《全长人源膀胱癌抗体库的构建及双表达载体pdgb4的构建》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、lIIYIIIIllllllllll9lllllll9lllll7llllll3lllllll2lllll唑硕士学位论文全长人源膀胱癌抗体库的构建及双表达载体pDGB4的构建硕士研究生：张哲欢指导教师：谭万龙教授周辰教授摘要膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，表浅性膀胱癌占全部膀胱肿瘤的75％～85％，经过经尿道膀胱肿瘤切除术(TUR—BT)后，5年内复发率可能达70％，并有10％～20％患者可发展为浸润性膀胱癌。肌层浸润性膀胱癌行根治性膀胱切除术后，高达50％的患者会出现转移，5年生存率为36％-'---54％，针对这部分复发及转移膀胱癌的治疗是泌尿外科的难点和研究方向。很早就

2、有人提出对肿瘤进行“靶向治疗”的新思路，“靶向治疗"的最大好处就在于单克隆抗体针对肿瘤的特异性靶点起作用，治疗效果显著，在杀伤肿瘤细胞的同时基本不损伤正常组织，被认为是未来肿瘤治疗中最具有前景的研究方向。如果能筛选到特异性针对膀胱癌的单克隆抗体，将可能提高复发性、转移性膀胱癌的客观缓解率(ORR)和无疾病进展率。20世纪70年代杂交瘤技术的问世，人们能够制备具有很好特异性的单克隆抗体，但由于这些抗体的异源性，在用于人类疾病的治疗时，会产生人抗鼠抗体反应(HAMA反应)。鼠源单抗即使经过人源化改造，也不可能完全去除抗体的免疫原性，而鼠源抗体的人源化改造本身是个耗时、耗力的工作，经

3、过改造的人源化抗体空间构型可能发生改变，亲和力往往大大下降，同时由于抗体本身的效应功能有限，很难达到预期的作用。为了尽可能减少药用抗体的免疫原性，理想的抗体应为全长人源抗体。中文摘要抗体库技术使抗体、特别是人源抗体的制备发生了质的飞跃。目前应用最广泛的展示和筛选人源抗体的技术是噬菌体展示技术，该技术不需抗原免疫，可以直接克隆人源抗体基因，将抗体片段与噬菌体的外壳蛋白相融合并展示于噬菌体表面，然后采用相应的抗原对抗体进行富集，通过几轮“吸附一洗脱一扩增"的筛选，最后筛选到人源单克隆抗体。但包括噬菌体展示技术、核糖体展示技术、酵母菌展示技术在内的常用的人源抗体展示技术，都没有或者有

4、着与哺乳动物细胞不同的蛋白质折叠和转录后修饰功能，所以其所展示的抗体不能形成正确的三级结构，亲和力往往较低，表达及纯化难度大，且只能筛选到抗体片段(单链抗体可变区片段scFv或者抗原结合片段Fab)而非全长抗体，为了进一步应用，所分离到的scFv必须改造成全长的抗体，用哺乳动物细胞进行表达时，很多改造后的免疫球蛋白G(IgG)分子结合能力都下降。这些问题，大大阻碍了人源抗体的筛选，延缓了人们筛选单克隆抗体用于疾病诊断、治疗的步伐。一个理想的用于筛选治疗性抗体的展示系统应该是以哺乳动物细胞为基础，可以提供蛋白质的正确折叠和转录后的修饰功能，而且能够展示全长抗体，所表达的抗体在分子

5、结构、理化性质和生物学功能方面最接近于天然的高等生物功能蛋白质。因此，哺乳动物细胞展示技术是目前最理想的筛选人源抗体的技术。近10余年来，研究者尝试利用哺乳动物细胞表面展示技术用于人源抗体的筛选，通过在重链或者单链抗体的3’端融合血小板衍生生长因子受体跨膜(transmembranedomain，TM)序列，可以在哺乳动物细胞表面展示全长人源抗体或者单链人源抗体，并采用该技术筛选到抗原特异性的抗体。因为抗体库技术扩增的是全套的人源抗体重链跟轻链基因且未经抗原免疫，所以抗体库的多样性越大，从中筛选到高特异性、高亲和力针对特异性抗原的单克隆抗体可能性越大，但目前的哺乳动物细胞表面展

6、示技术所构建的抗体库容量多局限于10‘’106，抗体库的多样性不足，不能满足筛选高亲和力抗体的要求，这些局限性在很大程度上阻碍了哺乳动物细胞表面展示技术在治疗性抗体研发中的应用。我们在第一部分实验中，成功构建了大容Ⅱ硕士学位论文量的膀胱癌特异性的全长人源抗体库，为筛选膀胱癌特异性的、高亲和力的全长人源抗体奠定基础。为了在哺乳动物细胞表面展示全长抗体，抗体的重链和轻链需要同时表达于同个细胞，要达到这个目的，可以采用共转染的方式将重链和轻链表达载体转入细胞，或者将含有双表达框架的载体转入细胞。为了构建用于表达全长抗体的双表达框架载体，第一步需要将重链和轻链插入载体。目前，只能将两个

7、片段分别插入单个的双表达载体中。然而，这是个费时费力的过程，降低了抗体库构建的效率，理想的方法是，可以通过一步连接将重链和轻链插入一个双表达载体中。我们在第二部分实验中，成功构建了双表达载体pDGB4，只需通过一步4片段连接，就可以将抗体的重链全长(或重链可变区)和轻链全长同时插入载体并实现高效连接及在哺乳动物细胞表面的高效表达，可以大大减少抗体库构建的时间，提高筛选效率。第一部分：全长人源膀胱癌特异性抗体库的构建及在哺乳动物细胞表面的展示目的：通过真核表达载体pDGB—HC—TM，构建大容