asiaⅰ型口蹄疫双效表达载体构建及表达

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1、硕士学位论文摘要2008笠摘要口蹄疫(Foot．and．mouthdisease，FMD)是由13蹄疫病毒引起的一种烈性传染病，严重危害畜牧业生产，对流行国家造成了巨大的经济损失。目前，接种疫苗仍是防治该病的重要手段之一，现有的疫苗接种动物后，虽能诱导免疫动物产生体液和细胞免疫反应，但其在免疫目标动物后，都会有一段时间的有效抗体产生期，即免疫空白期。动物在这一时期若遇到病原微生物的入侵往往会造成疫病流行。为了解决这一问题，本研究以AsiaI／JQ株为模板，进行了双效疫苗的探索研究，获得了以下结果：1．用RT-P

2、CR得到针对FMDV基因组5’非编码区的AS片段、PI+2A结构蛋白基因和3C非结构蛋白基因，将PI+2A、3C和AS依次克隆至T载体，测序结果表明，已得到正确的目的基因片段。2．将目的基因AS、PI+2A+3C依次亚克隆到逆转录病毒表达载体pQCXIX的多克隆位点I和II中，经酶切、PCR鉴定及测序分析，表明成功构建了FMDV双效表达载体pQC．AS．PI+2A+3C。3．将重组逆转录病毒载体在脂质体介导下转染AmphoPack293细胞，收获经AmphoPack293包装的假病毒，并在Polybrene(聚

3、凝胺)的介导下感染靶细胞BHK．21，RT-PCR检测表明双效表达质粒中的AS在细胞中得到了有效转录；4．经间接免疫荧光检测证实，口蹄疫的PI+2A基因在BHK．21细胞中能稳定持续表达；本试验成功构建了双效表达载体，为AsiaI型双效疫苗的研制奠定了基础。关键词：AsiaI型口蹄疫；免疫基因；治疗基因；双效疫苗硕士学位论文Summary2008年Summary，Foot-and—mouthdisease(FMD)isanextremelycontagiousanimaldiseasecausedbyFoot—

4、and—mouthdiseasevirus(FMDV)，whichdoseseriousharmtoAnimalHusbandryProductionandcausesgreateconomiclosstothosecountriesthatspreadsFMD．Atpresent，vaccinationisstilloneofanimportantmethodstocontrolFMD，Butachallengetothedeveopmentofvaccinesagainstmicrobiologyisthe

5、existofimmunizationblackandthelatentperiod，diseaseswouldoutbreakwhenanimalschallengedwithvirusduringtheimmunizationblackaswellasanimalsinoculatethevaccineduringthelatentperiod．Inthisstudy,tosolvethisproblem，abi-funcationalvaccineWasstudied、^，itllAsiaI／JQstra

6、in．1．ADNAfragmentfromthe5’UTRandstructuralproteinPl+2Aandnonstructural3CofFoot--and·-mouthViruswasamplifiedbyRT-PCR,theywereinsertedintopMD18·—Tvectorforsequencing．2．ThenthefragmentASgeneweresubclonedintotheMCSIandtheP1+2A+3CgeneofFMDVwassubclonedintotheMCSI

7、IofthevectorpQCXIX．TherecombinantplasmidnamedpQC-AS-PI+2A+3Cwasidentifiedbyenzymedigestion，PCRandsequencing．TheresultsshowedtherecombinantexpressionvectorhadAntisensenucleotideandP1+2A+3Cthatcouldbeconstructed．3．RecombinantplasmidspQC-AS-P1+2A+3CWasconstruct

8、ed，andthenpseudovirusWasobtainedbytransfactingrecombinantretroviralvectorpQC·AS—Pl+2A十3CintotheAmpho-pack293packagecells．BHK一21cellswereinfectedbypseudovirusmediatedinpolybrene．RT—PCRshowedtheAn