asiaⅰ型口蹄疫双效表达载体在bhk

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1、AsiaⅠ型口蹄疫双效表达载体在BHK本研究将构建好的双向反义表达载体PQC-AS-P12A3C经脂质体2000转染Ampho-pack293细胞，收获假病毒，在聚凝胺的介导下将其转染到BHK-21细胞，一定时间后进行检测。通过荧光抗体染色、目的基因的整合鉴定和RT-PCR检测等表明，目的基因P12A在细胞中成功表达，且已经整合到细胞染色体基因组中，病毒抑制试验则表明重组反义质粒对FMDV的产生起到一定的抑制作用。关键词：AsiaⅠ型口蹄疫病毒双效表达载体BHK-21细胞转染表达AsiaⅠ型口蹄疫双效表达载体在BHK-21细胞中的表达韩晓荣1，刘纪省（通讯杨彬21.海南科技职业学院，海南海口

2、（5711261）2．中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室，甘肃兰州730046）中途分类号S854.43文献标志码B摘要本研究将构建好的双向反义表达载体PQC-AS-P12A3C经脂质体2000转染Ampho-pack293细胞，收获假病毒，在聚凝胺的介导下将其转染到BHK-21细胞，一定时间后进行检测。通过荧光抗体染色、目的基因的整合鉴定和RT-PCR检测等表明，目的基因P12A在细胞中成功表达，且已经整合到细胞染色体基因组中，病毒抑制试验则表明重组反义质粒对FMDV的产生起到一定的抑制作用。关键词AsiaⅠ型口蹄疫病毒双效表达载体B

3、HK-21细胞转染表达口蹄疫（FootandMouthdisease，FMD）是由口蹄疫病毒（FootandMouthdiseasevirus，FMDV）感染引起的猪、牛、羊等偶蹄动物共患的一种急性、热性、高度接触性的一种传染病[1]。目前，口蹄疫的防治主要还是依赖于有效的疫苗，但传统疫苗在安全性方面还存在一定的隐患，因此研制安全有效的新型口蹄疫疫苗成了口蹄疫工最为迫切的任务[2]。经过研究人员几十年的不懈努力，在口蹄疫基因疫苗的研究方面也取得了一些进展，但还是仅停留在研究阶段，究其原因主要是口蹄疫基因疫苗出现时间短，理论基础和实验技术不成熟。除此之外，由于表达不出足量的免疫原，口蹄疫基因疫

4、苗在免疫应答方面经常达不到预期水平。因此当前口蹄疫基因免疫研究的主要思路是如何增强或改进基因疫苗的免疫效果，进一步提高口蹄疫基因疫苗的安全有效作用。而且现存的疫苗在免疫目标动物后，抗体产生还需要一段时间。如果动物在这一时期遇到微生物的入侵往往会造成疫病流行，因此在疫病的潜伏期和发病期紧急接种疫苗后效果都不理想，因此我们首次提出了动物疫病双向防治的研究思路，目的是解决现在的疫苗存在的免疫空白期和紧急接种后效果不理想问题，力求通过一种产品，同时具有免疫预防与治疗的双重功效，使基因工程疫苗在免疫效力上有所突破，研究理论上有所创新。1材料与方法1.1材料Amp-293细胞、BHK-21细胞及FMDV

5、各种抗血清均由本实验室提供，双效表达载体pQC-AS-P1+2A+3C由构建[3]，脂质体Lipofectamine2000购自invitrogen;聚凝胺(polybrene)为Sigma公司产品；E.Z.N.A.Endo-freePlasmidMiDikitDNA提取试剂盒，购自OMEGA公司；JM109有本实验室提供。1.2方法转染包装细胞Amp-293[4]用中量质粒提取试剂盒提取阳性重组质粒，提取的重组质粒的浓度（OD260）应在0.1～1.0之间，转染质粒的纯度（OD260nm/OD280nm）一般要求在1.7～2.1之间。在转染前1d，用无抗生素的培养基培养Amp-293细胞，

6、在每个培养皿中放入1～2个严格灭菌的飞片，待细胞融合度达到80%～90%时即可进行转染，转染时DNA与转染试剂LipofectamineTM2000的配比应达到DNA(μg):LipofectamineTM2000=1:2～1:3,按转染试剂LipofectamineTM2000的说明操作。转染后，将细胞放到37℃,5%CO2的培养箱中培养。2结果2.1目的基因整合的PCR鉴定　　由图1可ｘ知，扩增出约为2300bp的条带，而对未感染的BHK－21细胞未扩增出条带，说明P12A已整合到靶细胞的基因组中(见图1)。2.2RT-PCR检测RNA结果　　用已构建好的重组质粒pQC-AS-P12A3

7、C转染BHK21后24h及48h收取细胞培养上清液，用RT-PCR检测细胞内RNA的转录情况。试验设计空白细胞对照。结果用P1与P2引物对分别扩出了目的带，而空白细胞却没有扩出，说明均在BHK-21细胞中得到了表达（见图2）。　　　　2.3间接免疫荧光检测结果用收集的假病毒液感染培养48h的BHK-21细胞，用间接免疫荧光法检测AsiaI型口蹄疫病毒P12A基因的表达，结果（见图3-1，3-2）。2.4病毒抑