一种asia ⅰ型口蹄疫重组表位蛋白的表达及免疫活性

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1、一种AsiaⅠ型口蹄疫重组表位蛋白的表达及免疫活性作者：曹昭卫红飞张培因张永胜徐海飞胡小平万敏于永利王丽颖王华【摘要】目的构建一种能预防AsiaⅠ型口蹄疫病毒（FMDV）的感染表位重组蛋白疫苗，并对其免疫学活性进行研究。方法以AsiaⅠ型FMDVVP1上的B细胞表位和T细胞表位氨基酸序列为抗原位点，设计了包含上述位点的、具有最佳空间构象的重组蛋白，命名为“CZ1”。通过PCR及基因克隆等方法构建了其表达质粒，在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达。通过镍亲和层析和G25凝胶过滤层析纯化及复性，获得具有免疫学活性的重组蛋白CZ1。免疫豚鼠获得含针

2、对AsiaⅠ型FMDV中和抗体的血清，通过细胞中和试验及乳鼠中和试验，检测豚鼠血清中抗FMDV的保护性中和抗体滴度。结果该基因工程重组蛋白能够在动物体内诱导产生抗AsiaⅠ型FDMV具有保护性的中和性抗体。结论该基因工程重组蛋白有望开发成预防AsiaⅠ型FDMV感染的新型疫苗。【关键词】基因工程疫苗；FDMV；重组蛋白；活性检测　口蹄疫（FMD）是由FMD病毒（FMDV）引起的一种人和动物共患的急性发热性高度接触性的传染病〔1〕。传统FMD疫苗为弱毒疫苗或灭活疫苗，虽具有良好的免疫原性，但由于存在着灭活不彻底以及防护不当，而致病毒扩散传播的危险，这些

3、不安全因素促使人们寻求新型的疫苗。有研究证明，T和B细胞抗原原位串联连接构建而成的基因工程疫苗能引起有效的机体免疫应答，有利于具有保护性的中和抗体的产生〔2〕。本研究以AsiaⅠ型FMDVVP1上的B和T细胞表位氨基酸序列为抗原位点，采用计算机软件筛选出最佳的表位组合形式，拟利用基因工程方法构建、表达包含上述位点的氨基酸序列的重组蛋白，以探索一种新型的AsiaⅠ型FMDV基因工程疫苗。　　1材料与方法　　1.1菌种、质粒、引物、试剂、动物及FMD灭活疫苗　　JM109菌种、BL21(DE3)菌种、质粒pMD18T和pET28a(+)均由本室保存。

4、引物均由上海生工生物工程技术有限公司合成。TaqDNA聚合酶、限制性内切酶、dNTP、T4连接酶均购自TAKARA公司。IPTG购自Promega。其他试剂均为国产分析纯或试剂纯。层析介质NiSepharose4B、G25Superdex购自HealthcareGE。牛AsiaⅠFMD灭活疫苗购自内蒙古生物药品厂。豚鼠购自长春高新技术开发区医学动物实验研究中心。　　1.2重组质粒pET28aCZ1的构建及鉴定　　结合　　2.2pET28aCZ1重组质粒的构建　　通过PCR法合成目的基因经TA连接后，将其亚克隆至原核表达载pET28a

5、，获得重组质粒pET28aCZ1。pET28aCZ1经EcoRI和HindⅢ双酶切后，经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，与预期相符（预期为945bp），见图2。DNA测序结果与预期相符。　　2.3CZ1蛋白的表达及纯化　　将重组质粒pET28aCZ1转化至大肠杆菌BL21(DE3)表达菌后，接种至LB培养基中，待细菌生长至A600=0.6时，加入IPTG继续诱导培养3h。SDSPAGE分析显示，目的蛋白质分子量约为42kD，与预测结果相符，表达产量约占菌体总蛋白的50%左右。经诱导后的菌体，以8mol/L尿素裂解包涵体，上清经镍亲和层析和

6、G25凝胶过滤层析纯化，得到纯度达到90%的重组蛋白CZ1。见图3。　　2.4FMDV细胞中和试验　　观察在牛AsiaⅠ型FMDV活病毒的攻击下，CZ1蛋白免疫的豚鼠血清能否中和该病毒对BHK21细胞的感染。若该血清中含有针对牛AsiaⅠ型FDMV的中和抗体，则可中和FMDV对BHK21细胞的感染而使其存活。结果显示，免疫后第21天的3份豚鼠血清中和抗体滴度的几何均数为286，灭活病毒组为320，与PBS组（≤3）比较差异显著(P<0.01)。表明CZ1蛋白可以激活豚鼠体液免疫反应，产生了针对AsiaⅠ型FMDV的中和抗体。　　2.

7、5中和试验　　观察在活的AsiaⅠ型FMDV的攻击下，CZ1蛋白免疫的豚鼠血清能否保护乳鼠抵抗该病毒的攻击。将PBS组和CZ1蛋白免疫的各3份豚鼠血清分别按1∶32、1∶64、1∶128、1∶256稀释，分别与FMDV孵育1h后，注射4只乳鼠。如豚鼠血清中含有针对AsiaⅠ型FMDV的中和抗体，则乳鼠存活。结果显示，CZ1重组蛋白免疫的3份豚鼠血清中，针对AsiaI型FMDV的中和抗体滴度分别为1∶90、1∶256和1∶90，几何均数为1∶127，与PBS组比较差异显著(P<0.01)（表1）。表明CZ1蛋白可以激活豚鼠体液免疫反应，产

8、生针对AsiaⅠ型FMDV的中和抗体，能够保护乳鼠抵抗同型活病毒攻击。表1CZ1蛋白免疫的豚鼠血清中抗FM