β-乳球蛋白抗原表位谱的解析及关键抗原表位串联体的重组表达与鉴定

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1、分类号：R446.61学校代码：10062密级：学号：2012602121硕士学位论文MASTER’SDISSERTATION论文题目：β-乳球蛋白抗原表位谱的解析及关键抗原表位串联体的重组表达与鉴定TITLEAnalysisofβ-lactoglobulinepitopesandrecombinantexpressionandidentificationofkeyepitopesconcatemer（国家自然科学基金面上项目81371882）一级学科：临床医学二级学科：临床检验诊断学论文作者：侯丽英指导教师：李会强教授天津医科大学研究生院二〇一五年五月分类号：R446

2、.61学校代码：10062密级：学号：2012602121学位类别：科学学位专业学位学科门类：医学硕士学位论文MASTER’SDISSERTATION论文题目：β-乳球蛋白抗原表位谱的解析及关键抗原表位串联体的重组表达与鉴定TITLEAnalysisofβ-lactoglobulinepitopesandrecombinantexpressionandidentificationofkeyepitopesconcatemer（国家自然科学基金面上项目81371882）一级学科：临床医学二级学科：临床检验诊断学论文作者：侯丽英指导教师：李会强教授导师组成员：李迺昶天津

3、医科大学研究生院二〇一五年五月学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是我个人在导师指导下独立进行研究工作取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容和致谢的地方外，论文中不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名：日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解天津医科大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送

4、交论文，并编入有关数据库。保密，在年解密后适用本授权书。本论文属于不保密。（请在相对应的方框内打“√”）学位论文作者签名：日期：年月日导师签名：日期：年月日中文摘要目的：血清特异性IgE是诊断食物过敏的重要手段，标准化已知抗原是研制体外特异性IgE诊断试剂的重要前提，制备食物致敏组分的抗原表位重组蛋白是解决抗原标准化的重要措施。本研究以牛奶中最重要的过敏原“β-乳球蛋白”为例，从分析其抗原表位入手，分析重要抗原表位与患者血清sIgE的反应频率，从而筛选出其关键抗原表位并构建关键抗原表位重组体，尝试采用抗原表位重组体替代天然蛋白的可能性。方法：（1）β-乳球蛋白关键抗原表

5、位筛选及其血清异质性分析：首先在NCBI数据库查得牛奶β-乳球蛋白的氨基酸序列（162个氨基酸），用末端重叠的方法合成β-乳球蛋白的多肽，然后用斑点印迹的方法，以20例牛奶过敏患者血清中的特异性IgE作为一抗，观察多肽与牛奶过敏患者的反应频率有无差异及不同个体间所识别的多肽有无差异。（2）β-乳球蛋白关键抗原表位串联重组体的构建及其初步应用研究：将反应频率最高的3个多肽进行串联表达，相邻两个多肽之间用一个甘氨酸做接头，首先用DNAStar生物信息学软件对3个表位的6种组合方式进行预测，选出最佳组合方式；委托上海生工生物有限公司合成关键抗原表位串联体的DNA序列，并与pE

6、T-42a（+）质粒载体进行连接，将构建好的质粒转化到BL21（DE3）感受态细胞中，用IPTG诱导剂进行诱导表达，最后利用镍柱纯化出单一组分的关键抗原表位串联体重组蛋白，最后采用western-blot、斑点印迹方法和活性氧传递均相发光免疫测定技术鉴定重组蛋白的免疫学活性。结果：（1）患者血清中sIgE所识别抗原表位的异质性分析：在20例牛奶过敏患者血清的斑点印迹结果中有一部分血清所识别的多肽相同，如1号、5号、6号、11号牛奶过敏患者血清所识别的表位均为1号多肽，有一部分牛奶过敏患者血清所识别的表位均不完全相同。根据多肽反应频率的不同，筛选出β-乳球蛋白最I主要表位

7、的氨基酸序列为AA76-95、AA1-20、AA106-125，主要表位的氨基酸序列为AA91-110、AA61-81、AA121-140，次要表位的氨基酸序列为AA46-65、AA31-50、AA151-162。（2）β-乳球蛋白关键抗原表位串联体重组蛋白的表达及鉴定：通过DNAStar软件对理论上6种组合方式进行了分析，得到最佳组合方式，成功构建了大肠杆菌原核表达载体，IPTG诱导表达后，获得大小为36kDa左右的融合蛋白，并纯化得到单一组分的36kDa大小的重组蛋白，并经免疫印迹法、斑点印迹法鉴定其免疫活性，并利用重组蛋白作为检测抗