梭子蟹过敏原分析及原肌球蛋白关键抗原表位重组表达

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1、分类号：R446．61密级：学位类别：科学学位团专业学位口③学校代码：1062学号：2010602781学科门类：医学天蚌酱科鼻垮TlANJINM￡DICAl-U鞫IVEf毫SI-I广y硕士学位论文MASTER’SDISSERTATION论文题目：梭子蟹过敏原分析及原肌球蛋白关键抗原表位重组表达TITLE-TheswimmingcraballergensAnalysisandtrOpOmVOSlnKeye01tooerecomt)mantexoresslon^-^工上(市中小企业创新基金和市卫生局科技基金资助项目)一级

2、学科：临床医学二级学科：临床检验诊断学论文作者：李婵指导教师：李会强教授导师组成员：李遁昶副教授天津医科大学研究生院二。一三年五月学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是我个人在导师指导下独立进行研究工作取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容和致谢的地方外，论文中不包含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的研究成果，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名：盏日期：B年蛔‘日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解天津医科大学有关保留、使用学位论文

3、的规定，即：学校有权将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文，并编入有关数据库。保密口，在——年解密后适用本授权书。本论文属于不保密团。(请在相对应的方框内打“√”)学位论文作者签名：导师签名：期：”年捐‘日期：乃年蛔6日天津医科大学硕士学位论文目的：中文摘要食物过敏是当今重大的卫生学问题，食物过敏原的鉴定、纯化并制备标准化的过敏原，是食物过敏性疾病诊断和治疗的中心环节。本研究的目的是分别从分析过敏原和分析待检IgE

4、多态性两方面入手，力争解决当前血清特异性IgE检测所存在的问题。首先，以梭子蟹为研究对象，过敏患者血清中的特异性抗体IgE为“探针”，对梭子蟹中的主要过敏原组分进行分析；其次，以蟹过敏患者为研究对象，分析蟹过敏患者血清特异性IgE所针对过敏原的异质性。此外，选择甲壳类动物共同的过敏原．原肌球蛋白中的一段含有3个抗原表位的多肽，为重组表达对象，重组表达此段多肽，采用原核生物(大肠杆菌)作为表达系．统，制备原肌球蛋白肽段的多肽片段，为今后进行不同过敏原关键表位的串联体表达提供实验基础。方法：1．梭子蟹过敏原组分的分析：通过

5、去脂、抽提梭子蟹的总蛋白，SDS．PAGE分析蛋白组分，以蟹过敏患者血清中的特异性lee作为“探针”，经western-blot技术，分析梭子蟹中的主要与特异性IgE结合的组分。2．蟹过敏患者特异性IgE所针对的过敏原异质性分析：选取50例蟹过敏患者血清，经western．blot技术分析不同的患者血清中的特异性IgE抗体多态性，即分析蟹过敏患者血清特异性IgE所针对的过敏原个体间存在的异质性。3．原肌球蛋白中TM32a的重组表达及免疫活性鉴定：选择原肌球蛋白中的一段含有3个抗原表位的多肽(简称为删32a)。合成TM3

6、2a的DNA序列，选择pET42a为载体，EcoRI和XhoI双酶切构建质粒载体，克隆宿主菌Topl0扩增重组质粒，利用最常见的原核表达宿主菌大肠杆菌BL21(DE)，以IPTG诱导蛋白表达，并利用载体上的所携带的His标签蛋白，用镍离子纯化柱纯化出单一组分的TM32a蛋白，免疫印迹法鉴定该目的蛋白的免疫活性。天津医科大学硕士学位论文结果：1．梭子蟹过敏原组分的分析：梭子蟹的总蛋白粗提液中共观察到9条主要蛋白条带。在以阳性混合血清为探针的印迹中，94kD、74kD、70kD、48kD、43kD、40kD和36kD处均出

7、现了阳性反应条带，但蛋白浓度较高的74kD和70kD的蛋白与混合血清反应并不是最强的，相反，蛋白含量中等的94kD的蛋白与混合血清反应最强。2．蟹过敏患者血清特异性IgE所针对的过敏原的异质性分析：以单例蟹患者血清为研究对象的westem．blot实验中，发现不同的患者血清中的特异性IgE存在明显的异质性，即不同人的反应蛋白数量和种类都有所不同，其中：①1种蛋白为主要过敏原；②两种以上蛋白均为主要过敏原；③没有强反应的主要过敏原，而仅有几种较轻反应的过敏原。统计发现，其中以36kD的蛋白反应率最高，可达80％。3．原肌

8、球蛋白中TM32a的重组表达及免疫活性鉴定：合成的原肌球蛋白中的TM32a的DNA序列大小为96bp左右，与pET-42a连接构建质粒载体，大小为6030bp左右，将构建好的质粒转化大肠杆菌BL21(DE)，IPTG诱导表达后，获得大小为34kD左右的重组蛋白TM32a，将重组蛋白经镍离子柱纯化柱纯化后，获得单一组分的34kD大小