虾过敏原Pena1抗原表位的关键氨基酸分析.pdf

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1、第42卷分析化学fFENXIHUAXUE)研究报告第11期2014年11月ChineseJournalofAnalyticalChemistry1604～1610DOI·10．11895／j．issn．0253-3820．140229虾过敏原Penal抗原表位的关键氨基酸分析牟慧高美须李淑荣王志东潘家荣赵杰支玉香李树锦赵鑫(农业部农产品加工重点实验室／中国农业科学院农产品加工研究所，北京100193)(北京农业职业学院，北京102442)(中国计量学院生命科学院，杭州31008)(北京协和医院变态反应科，北京100052)摘要建立了一种利用

2、表位抗体筛选虾过敏原Penal抗原表位中关键氨基酸的方法。利用生物信息学软件MEGA5计算Penal中表位的氨基酸组成和出现频率，并采用DNAMAN软件对SDAP数据库中致敏食物原肌球蛋白的氨基酸保守性分析，综合两种方法筛选出各表位可能的关键氨基酸，Epitope1：K，E，N；Epitope2：K，L，E；Epitope3：E，R，D，L，Q；Epitope5：K，L，Q。用丙氨酸取代并合成突变多肽。利用表位抗体，通过竞争性免疫斑点法及间接ELISA方法检测突变多肽的抗体结合能力，筛选出各表位的关键氨基酸。分别为：Epitopel：谷氨酰

3、胺；Epitope2：亮氨酸和谷氨酸；Epitope3：亮氨酸和天冬氨酸；Epitope5：亮氨酸。实验结果证明了此种筛选关键氨基酸的方法的可行性，为Penal致敏机理的研究及利用基因修饰脱敏提供了一定的理论依据。关键词Penal；抗原表位；突变多肽；关键氨基酸1引言虾蟹和鱼类因其味道鲜美，营养丰富，被广大民众所喜爱。但是虾类隶属于国际粮农组织(FAO)公布的八大类食物过敏原中的甲壳类过敏原J，虾过敏问题一直以来广受关注。研究表明，虾中主要过敏原是Penal，分子量36kDa，是一种原肌球蛋白J。在食物过敏中，过敏原中的抗原表位即抗原决定簇

4、起重要作用’4J。2002年，Ayuso等利用交叠肽合成法，用患者的过敏血清鉴定出Penal中有5个IgE结合区，共8个线性抗原表位，见表1。表位主要由5～20个氨基酸组成，其中每个氨基酸在表位中所起的作用均不同。有些氨基酸残基在表位中起关键作用，这些特定氨基酸的存在对蛋白质构象起了关键性的作用，其发生变化会引起蛋白质的功能降低甚至丧失J，即核心氨基酸或者关键氨基酸残基。因此，如何定位出过敏原中的关键氨基酸，并了解它们的作用机理，对脱敏具有重要意义。目前，已经有很多关于关键氨基酸的研究。筛选关键氨基酸的方法主要有两种，一是对所有过敏原进行序

5、列比对，找出其中表位区域所共有的氨基酸或氨基酸组合。Ernoto等。。通过序列比对的方法分析了腹足类及双壳类动物之间的交互作用。Liang等对3种蟹原肌球蛋白进行序列比对，分析其同源性超过99．2％。二是将表位区域的氨基酸进行定向突变，通过检测突变后表位区域的致敏性来筛选。早在1996年，Ikagawa等就利用氨基酸替代的方法，分析单个氨基酸取代对雪松花粉过敏原Cryi1表位活性的影响。Lehrer等发现将Penal的特定位置的氨基酸取代，将会使其抗原决定簇完全丧失免疫原性。何晓阳等利用定点突变的方法分析出了对人体尼古丁代谢酶CYP2A6和

6、CYP2A13的关键氨基酸残基。Zheng等¨通过将虾原肌球蛋白与人和猪的序列对比，利用变异氨基酸取代的方法，分析出F和s为peptidel0的关键氨基酸。Cheng等¨采用丙氨酸逐个替代的方法，分析筛选出了真菌主要过敏原Peneh18的关键氨基酸。为了研究氨基酸组成对Penal中表位活性的影响，本课题组以Penal中的一个IgE结合区(氨基酸序列为187—202)为研究对象的前期工作¨基础上，合成了Penal中其它4个IgE结合区，筛选出可2014~3．10收稿；20l474接受本文系公益性行业(农业)科研专项(No．201103007)

7、资助E—mail：meixugao@263．net第11期牟慧等：虾过敏原Penal抗原表位的关键氨基酸分析能的关键氨基酸，并用丙氨酸取代。采用Fmoc固相合成法分别合成突变表位肽，并采用电喷雾离子化质谱法(ESI—MS)及反相高效液相色谱法(RP—HPLC)检测合成的多肽的正确性及纯度。采用竞争免疫斑点法(Dot—blot)及问接酶联免疫吸附分析法(iELISA)方法分析突变后多肽的抗体结合能力，鉴定各表位的关键氨基酸，为Penal致敏机理的研究及利用基因修饰脱敏提供理论依据。2实验部分2．1仪器与试剂Aglientl100反向高效液相色

8、谱仪(美国Aglient公司)；WatersZQ2000电喷雾离子化质谱仪(美国Waters公司)；WD一9405B型水平摇床(北京六一仪器厂)；HH_4数显恒温水浴(江苏省金坛