一种asia ⅰ型口蹄疫重组表位蛋白的表达及免疫活性

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1、一种AsiaⅠ型口蹄疫重组表位蛋白的表达及免疫活性作者：曹昭卫红飞张培因张永胜徐海飞胡小平万敏于永利王丽颖王华【摘要】目的构建一种能预防AsiaⅠ型口蹄疫病毒（FMDV）的感染表位重组蛋白疫苗，并对其免疫学活性进行研究。方法以AsiaⅠ型FMDVVP1上的B细胞表位和T细胞表位氨基酸序列为抗原位点，设计了包含上述位点的、具有最佳空间构象的重组蛋白，命名为“CZ1”。通过PCR及基因克隆等方法构建了其表达质粒，在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达。通过镍亲和层析和G25凝胶过滤层析纯化及复性，获得具有免疫学活性的重组蛋白CZ1。免疫豚鼠获得含针对AsiaⅠ型FMDV

2、中和抗体的血清，通过细胞中和试验及乳鼠中和试验，检测豚鼠血清中抗FMDV的保护性中和抗体滴度。结果该基因工程重组蛋白能够在动物体内诱导产生抗AsiaⅠ型FDMV具有保护性的中和性抗体。结论该基因工程重组蛋白有望开发成预防AsiaⅠ型FDMV感染的新型疫苗。【关键词】基因工程疫苗；FDMV；重组蛋白；活性检测10　口蹄疫（FMD）是由FMD病毒（FMDV）引起的一种人和动物共患的急性发热性高度接触性的传染病〔1〕。传统FMD疫苗为弱毒疫苗或灭活疫苗，虽具有良好的免疫原性，但由于存在着灭活不彻底以及防护不当，而致病毒扩散传播的危险，这些不安全因素促使人们寻求新型的疫苗。有研究

3、证明，T和B细胞抗原原位串联连接构建而成的基因工程疫苗能引起有效的机体免疫应答，有利于具有保护性的中和抗体的产生〔2〕。本研究以AsiaⅠ型FMDVVP1上的B和T细胞表位氨基酸序列为抗原位点，采用计算机软件筛选出最佳的表位组合形式，拟利用基因工程方法构建、表达包含上述位点的氨基酸序列的重组蛋白，以探索一种新型的AsiaⅠ型FMDV基因工程疫苗。　　1材料与方法　　1.1菌种、质粒、引物、试剂、动物及FMD灭活疫苗　　JM109菌种、BL21(DE3)菌种、质粒pMD18T和pET28a(+)均由本室保存。引物均由上海生工生物工程技术有限公司合成。TaqDNA聚合酶、

4、限制性内切酶、dNTP、T4连接酶均购自TAKARA公司。IPTG购自Promega。其他试剂均为国产分析纯或试剂纯。层析介质NiSepharose4B、G25Superdex购自HealthcareGE。牛AsiaⅠFMD灭活疫苗购自内蒙古生物药品厂。豚鼠购自长春高新技术开发区医学动物实验研究中心。　　1.2重组质粒pET28aCZ1的构建及鉴定10　　结合文献报道，选取AsiaⅠ型VP1上的B和T细胞表位的氨基酸序列，结合计算机空间构象模拟筛选出多个T、B细胞表位串联形式的重组蛋白。用PCR法构建表位的基因序列，将其与pMD18T连接后，构建串联的重复序列

5、；采用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切后，将基因片段亚克隆至经同样双酶切的pET28a（+）质粒上，构建成含目的基因片段的pET28aCZ1重组质粒；送上海生工生物工程技术有限公司进行测序。　　1.3CZ1重组蛋白疫苗的表达　　将重组质粒pET28aCZ1转化至E.coliBL21(DE3)表达菌中，经LB平板筛选后，挑取单克隆接种至LB培养液，于37℃、220r/min振荡培养，当菌液A600=0.6时，加入IPTG至终浓度为0.5mmol/L，37℃、220r/min振荡诱导、培养3h，离心收集细菌。取诱导前后样品进行SDSPAGE鉴定。　　1.4CZ

6、1蛋白的纯化　　取10g湿菌与裂菌液（含8mol/L尿素）按1∶5(M/V)重悬后，4℃、搅拌4h。10000r/min离心15min，取上清加载至预先平衡的NiSepharose4B层析柱中。用含410mol/L尿素的洗涤液洗涤至A280到基线后，洗涤液中尿素浓度降至3mol/L，洗涤1h后，尿素浓度降至1mol/L洗涤3h后，洗脱CZ1蛋白；收集目的蛋白后，加载到预先平衡的G25Superdex层析柱中，收集CZ1蛋白。将每步骤留取的样品进行SDSPAGE鉴定。　　1.5豚鼠免疫　　取3只体重为300g左右豚鼠，股内侧肌肉注射CZ1蛋白质（200μg/只）

7、，同时设立PBS对照和AsiaⅠ型FMDV灭活疫苗阳性对照。免疫后第21天采集血清。　　1.6中和试验　　①96孔板细胞培养板中加50μl/孔的细胞维持液，再加入50μl/孔倍比稀释的免疫后21d的豚鼠血清，最后加入50μl/孔200TCID50稀释的病毒，CO2培养箱中孵育1h后，加入BHK21细胞，CO2培养箱中培养72h后，萘黑蓝染色，Karber法计算血清中和抗体滴度。②取灭活补体的免疫21d后的豚鼠血清分别按1∶32、1∶64、1∶128、1∶256稀释，病毒用维持液稀释至200TCID50/100μl，将病毒稀释