全长人源抗肝癌哺乳动物细胞表面展示抗体基因库的构建及初步研究

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1、分类号UDC博士学位论文密级全长人源抗肝癌哺乳动物细胞表面展示抗体基因库的构建及初步研究—1●J●1●'●●l●LjonStrUCnonannDr】【maIVStUClV0IamammaⅡanceⅡ-basedfuⅡ·len啦an曲ody啦playHbraryfortarge血ghepatoceⅡularcarciIIoma作者姓名：李峰学科专业：病理学与病理生理学学院(系、所)：中南大学肿瘤研究所指导教师：李官成教授论文答辩日期答辩委员会主中南大学二O一二年十一月原创性声明本人声明，所呈交的学位

2、论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。作者签名：学位论文版权使用授权书本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留学位论文并根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以采用复印、缩印或

3、其它手段保存学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》，并通过网络向社会公众提供信息服务。作者签名：导师签名——日期：一L月一日摘要★第一章EGFL7的生物信息学分析目的：采用生物信息学方法分析EGFL7基因表达谱和密码子偏好性，并重点对蛋白质的理化性质、结构功能特点和抗原表位进行预测。方法：利用各种生物信息学分析数据库和在线软件资源对EGFL7基因进行预测分析。结果：通过生物信息学分析，EGFL7基因的ORF全长1569bp，编码一种含273个氨基酸的蛋

4、白，蛋白质预计分子量约30kDa。EGFL7蛋白在人正常肝组织中有少量表达。密码子偏好性分析发现稀有密码子所编码的氨基酸占总氨基酸数目的21％。在大肠杆菌体内蛋白质的代谢半衰期大于10小时。信号肽预测分析显示EGFL7蛋白有明显的N端信号肽序列。EGFL7蛋白定位在胞质为主，该蛋白存在着一个很弱的跨膜螺旋。EGFL7从属于EGF基因超家族，存在EGF保守结构域。antigic软件分析EGFL7蛋白有12个可能的抗原位点。结论：用生物信息学的方法成功预测了EGFL7的结构和功能，为后续实验顺利进行提

5、供指导。第二章EGFL7融合蛋白的原核表达、纯化及活性鉴定目的：构建pET2la(+)．nⅨ．EGFL7原核表达载体，高效表达、纯化EGFL7蛋白，并对其表达产物作活性鉴定。方法：利用分子克隆技术将EGFL7插入到原核表达载体pET22a(+)一TRx中，转化入E∞，fDH5仅，经菌落PCR、双酶切验证并测序。将阳性重组子转化入表达菌株EcD疗Rose似DE3)，经IPTG诱导表达后，表达的重组蛋白经His．切g纯化试剂盒纯化后复性。ELISA方法分析其蛋白活性。’本研究得到国家973计划(编号：

6、20lOCB833605)资助中南大学博士学位论文中文摘要结果：构建的原核表达载体pET21a(+)．ⅡⅨ一EGFL7经测序验证，序列正确。蛋白EGFL7以包涵体形式高效表达，经纯化后纯度达90％以上。ELISA方法鉴定复性后的蛋白具有结合活性，能够用于后续抗原实验用。结论：成功获得了有活性的EGFL7蛋白，为筛选EGFL7展示抗体奠定了坚实的基础。第三章用于在哺乳动物细胞表面展示全长抗体的真核表达载体pcDNA3一CHm和pcDNA3一CLm的构建目的：在载体pcD】姚3．CH和pcDNA3一C

7、L的基础上构建哺乳动物细胞表面展示全长抗体的真核表达载体pcDNA3．CHm和pcDNA3-CLm。方法：根据载体pcD】妣3．CL中的序列，设计多条PCR特异性扩增引物，扩增出片段脚entl和触舯ent2。应用两片段融合PCR的方法将两片段融合为一个片段触gment3，在￡冶gment3的5，端和3，端分别引入了酶切位点胁挖dIII、＆出I，通过克隆构建真核表达载体pcDNA3．CLm。分两步克隆来对载体pcDNA3．CH进行必要的改造，首先根据载体pcDNA3．CH中的序列，设计多条PCR特异

8、性扩增引物，扩增出片段台a班ent4和台agIllent5。应用两片段融合PCR的方法将两片段融合为一个片段触gment6，在嘶ent3的5’端和3’端分别引入了酶切位点＆c口、．砌DJ。并通过这两个酶切位点将片段触gIIlent6连接入载体中。第二步克隆，设计引物扩增出片段触gment7，在台a鲫ent3的5’端和3’端分别引入了酶切位点恸砌胍肋P，，通过克隆构建真核表达载体pcDNA3．CHm。结果：获得的真核表达载体pcDNA3一CHm和p印INA3-CLm，通过必要的酶切鉴