天然的人源性核糖体展示抗体库的构建与初步鉴定

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1、天然的人源性核糖体展示抗体库的构建与初步鉴定【摘要】目的构建库容量大、多样性好的核糖体展示单链抗体（ScFv)库,为进一步筛选ScFv奠定基础。方法从健康自愿者的外周血淋巴细胞提取mRNA,经RTPCR分别扩增抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)DNA,进而连接形成ScFvDNA。将其连接TVector转化E.coliJM109大肠埃希菌，经蓝白筛选，挑取9个阳性克隆测序以鉴定ScFv组装。通过体外转录和翻译对抗体文库进行初步鉴定。结果VH、VL和ScFvDNA分别约为350、650和1100bp。本试验成功构建ScFv核糖体展示模板。结论成功构建天然的大容量核糖

2、体展示人源性ScFv文库,为下一步利用亲和富集筛选技术获得各类ScFv奠定基础。【关键词】抗体；单克隆；核糖体；埃希氏菌属；基因文库单链抗体(SingleChainfragmentvariant,ScFv)是通过基因工程技术方法把重链可变区(VH)、轻链可变区(VL)连接而构建的重组蛋白，较之完整抗体具有分子量小、通透性高等特点，更适合用于药物靶向和免疫生物治疗。构建ScFv可通过传统的杂交瘤技术或噬菌体展示技术制备，而近年来问世的核糖体展示技术(ribosomal8display，RD)是一种不受细胞转染和表达等因素影响的完全细胞外展示系统工程[1]，简化了ScFv的筛

3、选过程，可望筛选到高亲和力的ScFv。本研究选用健康自愿者的外周血淋巴细胞为材料，构建天然大容量核糖体展示ScFv文库,为下一步筛选各类ScFv奠定基础。1材料与方法1.1材料和试剂mRNA提取试剂盒（瑞典Amersham公司）；TaqDNA聚合酶，T4DNA连接酶，兔网织红细胞裂解液，T7RNA聚合酶，rNTPsRNaseinhibitor（美国Promega公司）；pMD18TVector载体（日本Takara公司）；RNA抽提试剂盒（瑞士Roche公司）；脂多糖（LPS，美国SigmaAldrich集团公司）。1.2方法1.2.1mRNA提取和RTPCR抽取10

4、位健康志愿者外周血，其中男性5例，女性5例，用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞。按mRNA提取试剂盒(Amersham)说明书所述步骤提取mRNA。以Oligo(dT)为引物逆转录合成第一链cDNA，具体方法按说明书进行。1.2.2ScFvDNA的构建及扩增利用mRNA反转录合成cDNA第1链，以第1链为模板,扩增抗体基因按文献扩增人类主要的轻重链可变区基因，所有引物序列根据抗体两端相对保守的框架区设计[23]。所需引物和寡核甘酸均由上海生工负责合成。8扩增重链VH可变区引物为：VH/T7（上游）：5’GCAGCTAATACGACTCACTATAGGAACAGACCACCAT

5、GAGGTSMARCTGCAGSAGTCWGG3’VH2（下游）：5’TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGGCCCC3’其中划线部分为T7启动子序列；黑体部分所示为核糖体结合位点。扩增VL可变区引物为：VL（上游）：5’ATTGAGCTCACCCAGTCTCCA3’Ck（下游）：5’GAACACTCATTCCTGTTGGAGCT3’引物中的简并碱基符号M=A/C,R=A/G,S=C/G,W=A/T，按程序1(30个循环:94℃×1min→55℃×2min→72℃×2min)进行PCR，分别扩增VH和VLcDNA,对扩增产物进行纯化并测定其浓度

6、。Linker序列为(Gly4Ser)3，该引物两端的各18个碱基分别与VH和VL基因的3’端和5’端相互补。将VH、VL和Linker等量混合后,经程序2(7个循环:94℃×1min→63℃×4min)进行聚合反应使VH和VL籍linker8DNA连接形成ScFvDNA。然后通过引物VH2和CK进行PCR扩增,执行程序1，使聚合的ScFvDNA得到扩增。1.2.3核糖体展示抗体库的构建将最后纯化的核糖体ScFv展示模板连接TVector，用BioRad电转化仪将连接产物转化入E.coliJM109,通过蓝白筛选,随机挑取9个克隆子，进行菌落PCR法验证。将验证阳性的克隆

7、子测序，分析序列，以此评价文库序列的多样性。1.2.4核糖体展示抗体库的初步鉴定将PCR扩增的随机ScFvDNA文库进行离体转录（终浓度/100μL：1×转录Bufffer、10mmol/LDTT、100URNaseinhibitor、0.75mmol/LrNTPs、40UT7RNA聚合酶、2μg随机DNA文库），37℃反应2h，回收mRNA。转录产物再用兔网织红细胞裂解液系统进行离体翻译（50μL的体积加入兔网织红细胞裂解液35μL、1mmol/L不含亮氨酸的氨基酸复合物0.5μL、1mmol/L不含甲硫氨酸的氨