人源fab抗体库构建及rh（d）抗体筛选和其特性检测

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1、中文摘要人源Fab抗体库的构建和抗RH(D)抗体的筛选及特性鉴定研究生：张海燕导师：李厚达教授徐向明副教授D抗原是所有血型系统中除A，B抗原之外最有效力的红细胞表面抗原，其对应的抗体为Iul∞)抗体，Rh(D)抗体具有很重要的临床意义。对于输血患者，会引起急性溶血性输血反应；对于D阳性胎儿，母体产生的Rh(D)抗体，能通过胎盘进入胎儿体内，引发新生儿溶血病(HDN)。可见研制Rh(D)抗体具有重要的临床应用价值。不过，由于小鼠的免疫系统不能识别单独的D抗原，无法采用传统的杂交瘤技术制备Rh单抗。本研究通过RT-

2、PCR的方法，成功地从RH血型阴性血清Rh(D)抗体阳性患者的外周血淋巴细胞中扩增出人的Fab基因片断，将其克隆入噬菌粒载体pComb3中，电穿孔转化感受态大肠杆菌XLl-Blue，加入辅助噬菌体VCSMl3超感染，构建了库容量为7．4x106的人源性Fab段噬菌体抗体库。利用Rh(一)RBC、Rh(+)RBC两种红细胞对构建好的噬菌体抗体库分别进行五轮“吸附一洗脱一扩增”的阴阳差异筛选，进行Rh(D)抗体的淘筛富集。获得l株表达Rh(D)抗体的阳性克隆，利用血凝试验和western-blot进行鉴定，结果表明

3、克隆正确。经测序比对，VH属VH3．23亚群家族，V1(属V1cIⅡ亚群Ⅸ家族。本研究通过克隆Fab基因构建了大库容量的人源性Fab段噬菌体抗体库，并通过淘筛法获得l株表达Iul(D)抗体的阳性克隆。为我国研制Rh(D)人源全分子IgG基因工程抗体和防治新生儿溶血病及溶血性输血反应的奠定了基础。关键词：D抗原；Rh(D)抗体；人源Fab抗体库；基因工程抗体ConstructionofHumanNaiveFabLibraryandCharacterizationofAnti-ItH(D)FabFragmentGe

4、neratedfromtheLibraryMD．Candidate：HaiYanZhangSupervisor：HoudaLiXiangMingXuAbstractIIlallblood—groupsystems．theDantigenisthemosteffectiveredbloodcellsurfaceantigenexcepttheA，Bantigens，itscorrespondingantibodyisRh(D)antibody．Rh(D)antibodyhasveryvitalclinicalsi

5、gnificance．Forthebloodtransfusionpatient，Rh(D)antibodyCaneansetheacutehemolyticbloodtransfusionresponse；fortheDmasculineembryo，RhfD)antibodywhichtheparentsubstanceproduces，Canenterembryoinvivothroughtheplacenta,andinitiatethenewborntodissolvehomeopathy(HDN)．

6、Soit’SnecessarytoresearchRh(D)antibody．However,becausemouse’SimmunesystemcannotdistinguishtheindependentDantigen,it‘sunabletodeveloptheRh(D)antibodybythetraditionalhybridismtechnology．FabfragmentgeneswereobtainedbyRT-PCRfromperipherallymphoeytesofRh(D一)patie

7、nts、Ⅳithanti-Rh(D)antibodies．TheobtainedFabgenesandpComb3×SSvectorweredigestedbYSfiIenzymeandligatedbetweeneachother．Therecombinantgeneswereelectro—transformationintocompetentE．coliXLl一blue．ThetransformedcellswereinfectedwithVCSMl3helperphagetoyieldrecombina

8、ntFabphageantibody．AhumanFabphageantibodylibrarywith7．4xlooeapabilityWasconstructedsuccessfully．Thecolls恤lctedlibrarywaspannedby5roundsof“adhesion-amplification—ehtion'’，andtheoriegnalantibodyli