Fab段噬菌体抗体库的构建及抗人β1AR抗体克隆的筛选、表达和鉴定

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1、中山大学硕士学位论文Fab段噬菌体抗体库的构建及抗人β<,1>-AR抗体克隆的筛选、表达和鉴定姓名：左润秋申请学位级别：硕士专业：药理学指导教师：赵树进2003.5.30瓤如文学硬士擎经论文鼬段噬毽转挽钵痒静捻建教撬太叠．一AR拣捧竞淹魏撵选、袭遮和鉴定Fab段噬菌体挽体库的构建及抗入§，～A鬏抗体克隧的筛选、表达和鉴定专鼗：嚣理学硬士磷究嫩：庄濒教导舞：赵辩遴教授中文摘要《、k璺’簿上艨豢§§受体(§adrenergiereceptor,§-AR)在传肉分布广泛，分学罄一蓉列重要熬裳兹学效痊。翔；蠹管翁扩张，，§皴麴羧缭，耱源裁耀菸

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3、毽可辍豫羚豫型瞎男瞧浆基懿上述姣戆，嚣艇还霹鞋避免月德豢拣撼醚基疑繁寒豹放射蛙嚣繁等阕鼹。另一穷蕊，溅型特髯瞧豹受体抗藩还霉叛矮予受嚣挠疆衰位(epitope)豹分撵，其影嫡浆基每受蒋络合豹特毪漩及掰爨有魏激遥察海筑锋粥帮海磷斑器-AR鬟镖T一条有效途径。毽露予多竟隆抗体祷舅憔不强，容器亏{怒交叉爱瘫，而采鹰杂交薅方法翻藩擎抗，操律繁琐，扶兔疫动物羽筛迭获得合逶豹擎蠢鬻藐体簧经道几个莠豹辩翔，基获褥不鞠的鼙抗霈要分别用不同的特异瞧抗服受疫动秘。再者，杂交瘸缨胞传代过稔中戆不稳定性，绘攀抗骢遮续大量铡鍪逸或了强大豹垂难，鼠i嚣毽隈翻了箕

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5、法从抗体嬲性的DCM患者约50ml乡F周血中分离淋巴细胞，妆TRIZOL试剂说明书操作提取总RNA25ug，OD2adOD2ao嶷t势2．0，电溶示心A宠整，没毒降瓣。并鞋越是模叛，Oligo(dT)20为逆转秉引物，在逆转录酶ThermoScript的催化作用下，合成eDNA第一链。以eDNA第一链为模凝，磐裂掰x凌3’臻弓}秘稻5’漆弓

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8、酌基因(装6对)。PCR葳斑条律为：94℃5min；94℃lmin，58。CImin，72℃2min,35cycles；72℃10min，分别扩增出熏链Fd段和K、^两轻链基因片段。琼B簿糖凝胶电泳示在约650bp处可见髓是的扩增条带，与理论值相符。，／用Sacl、Xba1分别双酶螺墨缝化圈牧蛇盖、x嚣轻链(K：玉或：1)以及噬粒L“]M30／mmb3，经1％琼脂糖凝胶电泳腐，分别切下约650bp和4kb的目的条带，再次纯化回l

9、芟DNA片鬏嚣，在1"4DNA连接薅懿撂蠲下进露连接。连接反纛产物寇电压2。5kV,耄容25uR电阻200

10、0的条件下进行电穿孑L转化入感受态细菌XLl．blue，计算转化率为1．4x10'。努爨焉SacI和Xbai激及XhoI帮Xba1迸符双酶留反盔诗算轻链库翡重组攀为8l％。提取轻链库噬粒DNA，用SpeI、Xho1分揭q双酶切已纯化回收的熬链Fd段PCR产物(Yl：Y3=1：1)跌及轻链库墟粒，经琼目旨糖凝胶魄泳后，分别切下目的条豢，再次纯化豳收DNA片段聪，在T4DNA连接酶的作用下进行连接。连接反应产物在相同的电转化条件下转化入感受态细菌XLl一blue，经K07辅助噬麓体超感染得到黪容量秀l。4xl妒戆组台文痒；魏枫挑取ls令嬲

11、缝竞隧撂蓥势糖取重缀噬粒，耀XhoI和XbaI进行戳酶切反成计算黛组率约为73％。疆入参l-ARECII26歉薅抗体痒迸簿啜辩一洗藐一犷蹭《轮筛选，隧毂豹噬蘩俸产出率由第一轮的1．1X10-8增加到第四轮的2．6×10～