人抗体fab段天然抗体库的建立

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1、人抗体Fab段天然抗体库的建立作者：韦晓明,苏明权杨安钢,温伟红,郝晓柯【摘要】目的:提取健康人外周血淋巴细胞的mRNA,利用反转录PCR方法,建立一个大容量的人抗体Fab段的天然抗体库。方法:收集健康者外周血,提取淋巴细胞,以淋巴细胞mRNA为模板,扩增人抗体Fab段,连入载体pComb3内,利用电转化的方法,构建噬菌体抗体库。结果:最终建立了重链库为1.73×107,轻链库为8.52×104的天然抗体库,并利用酶切鉴定计算出实际库容为重链库1.21×107,轻链库4.26×104,所以理论上所建天

2、然噬菌体抗体库总的库容量可以达到5.15×1011。结论:成功构建了一个大容量的完全人源化的天然抗体库。【关键词】天然抗体库;Fab;反转录PCR自1975年单克隆抗体(mAb)问世以来［1］,mAb已广泛应用于临床疾病的诊断、防治及基础理论研究等领域,取得了令人鼓舞的结果。但鼠源性抗体用于人体防治会产生人抗鼠抗体（humanantimouseantibody,HAMA）,它不仅使治疗用mAb迅速失去效用,而且会引起过敏反应。为此这些年来,人们一直致力于鼠源mAb的人源化的工作。噬菌体抗体库是近十几

3、年来发展的一种新的技术［2,3］,8它使mAb的应用得到了进一步的推广,而且被广泛应用于mAb人源化,抗体亲和力提高等技术中。本研究中我们使用电转化的方法建立了大容量的人抗体Fab段天然抗体库,从而为进一步的抗体人源化工作打下良好的基础。1材料和方法1.1材料淋巴细胞分离液购自TBD生物技术中心;TRIzolreagent、反转录试剂盒购自Promega公司;DEPC购自Sigma公司;引物合成由大连宝生物公司合成;mRNA纯化试剂盒、TaqDNA聚合酶购自Invitrogen;DNA凝胶纯化试剂盒购

4、自上海华舜公司;蛋白胨、酵母提取物购自Oxoid公司;E.coliXL1Blue菌株为本室保存;载体pCOMB3由杨洁硕士馈赠。LB（蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl:10g/L,pH7.0）、GYT（丙三醇100mL/L、酵母提取物1.25g/L、蛋白胨2.5g/L,pH7.0）、SOC（蛋白胨20g/L、酵母提取物5g/L、NaCl0.5g/L、2.5mmol/LKCl、10mmol/LMgCl2、20mmol/L葡萄糖,pH7.0）等培养基为本室配置。PCR仪购自PE公司;电泳仪

5、购自BIORAD公司;台式高速离心机购自上海安亭科学仪器厂;高速冷冻离心机购自湖南仪表仪器总厂离心机厂;紫外分光光度仪购自Beckman公司;BIORADgenepulserII电脉冲基因转移仪购自BIORAD公司。8引物设计［2］:Fd5′引物:5′SAGGTGCAGCTCGAGSAGTCTGGG3′;5′SAGGTGCAGCTGCTCGAGTCTGGG3′。Fd3′引物:5′GCATGTACTAGTTTTGTCACAAGATTTGGG3′;5′CTCGACACTAGTTTTGC

6、GCTCAACTGTCTT3′;5′TGTGTGACTAGTGTCACCAAGTGGGGTTTT3′;5′GCATGAACTAGTTGGGGGACCATATTTGGA3′。κ链5′引物:5′GAMATYGAGCTCACSCAGTCTCCA3′。κ链3′引物:5′GCGCCGTCTAGAACTAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTTTGTGACGGGCAAG3′;5′GCGCCGTCTAGAACTAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTTTGTGACGGGCGATC

7、TCAG3′。λ链5′端引物:5′CASTYTGAGCTCACKCARCCGCCCTC3′。λ链3′端引物:5′GAGGGATCTAGATTATGAACATTCTGTAGG3′。S=CorG;M=CorA;Y=CorT;K=GorT;R=AorG。1.2方法1.2.1淋巴细胞分离2300名志愿者（2003/2004年本院健康体检者）抽取外周血1150mL,与淋巴细胞分离液以1∶1的比例混合,离心分离中层淋巴细胞。1.2.2RNA提取使用1010细胞/LTRIzol比例裂解淋巴细胞,提取总RN

8、A。然后根据mRNA纯化试剂盒提供的方法从中提取mRNA。81.2.3反转录及其扩增将纯化的mRNA按照反转录试剂盒提供的方法全部用来反转录,以获得的cDNA为模板,进行PCR扩增抗体Fd、κ和λ片段编码区。PCR条件为:Fd:94℃5min热启动,94℃1min变性,52℃1min退火,72℃2min延伸,共35Cycles。最后进一步延伸7min。反应体系为100μL。κ和λ:94℃5min热启动,94℃1min变性,56℃1min退火,72℃2mi