rh抗原fab抗体库的构建与筛选

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1、Rh抗原Fab抗体库的构建与筛选作者：陈琦　,张嘉敏,张海燕,朱自严,李厚达【摘要】目的:构建抗体库并筛选Rh抗原的Fab抗体。方法:收集5份血清中抗Rh抗体效价在1∶256～512的人淋巴细胞,提取RNA,用多对引物PCR扩增VH、Vκ、Vλ基因,并分别从pComb3xTT和pComb3xλ噬粒中扩增CH1、Cκ、Cλ,通过重叠PCR,构建重链Fd基因及完整的kappa、Lamda轻链,并进一步重叠PCR,获得Fab抗体片段。Fab经酶切、连接并电转化到噬菌体抗体表达载体pComb3xSS中,构建获得抗Rh的Fab抗体库,经4轮Rh(-)/Rh(+)红细胞阴/

2、阳淘筛,获得的阳性克隆分别进行血凝试验、Westernblot分析及测序鉴定。结果:构建获得总库容为7.4×106的Fab抗体库,并从中筛选得到1株能特异结合Rh抗原的Fab抗体。结论:应用基因工程抗体技术,成功获得了1株能与Rh(+)红细胞特异凝集的Fab抗体,为制备能用于临床的特异性强、效价高,并具有自主知识产权的Rh抗体打下基础。【关键词】Rh血型;基因工程抗体;噬菌体抗体库;Fab　　[Abstract]AIM:ToConstructFabantibodyagainstRhantigen.METHODS:Thevariableregionsoflight

3、andheavychainswereamplifiedbyRTPCRfromthePBMCsofvolunteerswithhigh13titer(1∶256512byinditectagglutation)antibodytoRhantigen.Meanwhile,thegenesofconstantregionsoflightandheavychainswereisolatedfrompComb3xTTandpComb3xλphagmidcarryingthetemplatesrespectively.VκlightchainandFdheavychai

4、nwerelinkedbythefirstsplicingoverlappingextensionPCR(SOE),andafulllengthFabgenewascreatedbythesecondSOE.TheFabgenewasligatedtophagmidpComb3HxSSandtransformedtoE.coliXL1Bluebyelectroporation.TheobtainedhumanFabphageantibodylibrarywaspannedusingRh(-)/Rh(+)RBCfourtimes.thephageantibod

5、iesagainstRhantigenwerehighlyenriched.Indirectagglutationtest,westernblotanalysisandsequencinganalysiswereperformedtodetectthespecificityofFabagainstRh.RESULTS:TherepertoireofhumanphagedisplayFablibrarywas7.4×106.Afterpanning,AFabclonewhichcouldbindtoRhantigenspecificallywasobtained.

6、CONCLUSION:AFabantibodythatspecificallyaggulatedRh(+)RBCisobtained,thismakesitpossibletoproduceRhantibodywithhighquantityandeffectioninourcountry.　　[Keywords]Rhantibody;geneticengineeringantibody;phagedisplayantibodylibrary;Fab13Rh血型是人类29个血型系统中最复杂、最富有多态性的一种,该血型根据红细胞表面是否有Rh抗原分为Rh(+)和R

7、h(-)两种。其临床重要性表现在:在Rh(-)人输入Rh(+)血后会产生Rh抗体,若再次输入Rh(+)血,则该受血者红细胞会因抗原、抗体反应发生溶血,从而引起严重的输血反应;而有Rh抗体的Rh(-)妇女怀孕时,母亲血中的抗体可通过胎盘进入胎儿体内,若胎儿是Rh(+)血,产生的免疫反应重则导致胎儿死亡,母亲流产,轻则引起新生儿溶血病的发生[1]。因此,Rh血型的临床意义仅次于ABO血型系统。在欧美等国,进行Rh血型检测已成为输血前的常规检查项目,故由该血型不合导致的种种并发症极少发生[2]。但在我国,因Rh定型试剂即Rh抗体严重匮乏,医院在输血前只鉴定ABO血型,

8、不做Rh血型的检测,以至