rh抗原fab抗体库的构建与筛选

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1、Rh抗原Fab抗体库的构建与筛选：陈琦　,张嘉敏,张海燕,朱自严,李厚达【摘要】目的:构建抗体库并筛选Rh抗原的Fab抗体。方法:收集5份血清中抗Rh抗体效价在1∶256～512的人淋巴细胞,提取RNA,用多对引物PCR扩增VH、Vκ、Vλ基因,并分别从pb3xTT和pb3xλ噬粒中扩增CH1、Cκ、Cλ,通过重叠PCR,构建重链Fd基因及完整的kappa、Lamda轻链,并进一步重叠PCR,获得Fab抗体片段。Fab经酶切、连接并电转化到噬菌体抗体表达载体pb3xSS中,构建获得抗Rh的Fab抗体库,经4轮Rh(-)/Rh

2、(+)红细胞阴/阳淘筛,获得的阳性克隆分别进行血凝试验、:ToConstructFabantibodyagainstRhantigen.METHODS:ThevariableregionsoflightandheavychainsplifiedbyRTPCRfromthePBMCsofvolunteerspb3xTTandpb3xλphagmidcarryingthetemplatesrespectively.VκlightchainandFdheavychainidpb3HxSSandtransformedtoE.col

3、iXL1Bluebyelectroporation.TheobtainedhumanFabphageantibodylibraryes.thephageantibodiesagainstRhantigenedtodetectthespecificityofFabagainstRh.RESULTS:TherepertoireofhumanphagedisplayFablibraryakesitpossibletoproduceRhantibodyaga公司。兔抗鼠M13抗体购自Pharmacia公司。　　1.2引物(1)重链

4、(VH)、轻链(Vκ、Vλ)可变区引物HFabVH1F:5′GCTGCCCAACCAGCCATGGCCCTGGTGCAGGTGCAGCAGTCTGG3′;HFabVH2F:5′GCTGCCCAACCAGCCATGGCCCAGAAGGAGATCACCTTGTCTGG3′;HFabVH3F:5′GCTGCCCAACCAGCCATGGCCTGCAGCTGKGAGGTGGAGTCTG3′;HFabVH4F:5′GCTGCCCCAGCCCAAATGGCCCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGG3′;HFa

5、bVHJaB:5′CGATGGGCCCTTGGTGGAGGCTGAGGAGACGGTGACCAGGGTTCC3′;HFabVHJbB:5′CGATGGGCCCTTGGTGGAGGCTC3′;HSCLam9:5′GGGCCCAGGCGGCCGAGCTCGTGCTGACTCAGCCACCTTC3′;HSCLam10:5′GGGCCCAGGCGGCCGAGCTCGGGCAGACTCAGCAGCTCTC3′;VHCL5B:5′CGAGGGGGCAGCCTTGGGCTGACC3′;(2)重链(CH)、轻链(C

6、、C)恒定区引物HIgGCH1F(sense):5′GCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTC3′;dpseq(reverse):5′AGAAGCCGGAACGTAGTCGTC3′;HKCF(sence):5′CGAACTGTGGCTGCACCATCTGTC3′;LeadB(reverse):5′GGCTGGTTGCATGGCGGCAGC3′;HLCF(sense):5′GGTCAGGCTGCCCCCAAGCCC3′;(3)组装引物LeadVH(sense):5′GCTGCCCAACCAG

7、CCATGGCC3′;RSCF(sense):5′GAGGAGGAGGAGGGCGGGGGAGGACCCAGGCGGCCGAGCTC3′;dpEX(reverse):5′GAGGAGGAGAGCGTAGTCGAGGAGGAGAGACGGAACGTC3′。　　1.3方法　　1.3.1外周血淋巴细胞的采集及总RNA提取收集5人份符合条件的抗凝血,分离淋巴细胞。按照TRIzol说明书提取淋巴细胞总RNA,以Oligo(dT)为引物逆转录合成单链cDNA。献血者应符合以下条件:O型血、Rh抗原阴性、血清中有抗Rh抗体(

8、5人份抗凝血的Rh抗体效价在1∶216-512之间)。　　1.3.2重叠PCR扩增Fab用VH、Vκ、Vλ、CH、Cκ、Cλ引物进行第1轮PCR,分别获得抗体重、轻链可变区的VH、Vκ、Vλ基因及重、轻链恒定区的CH、Cκ、Cλ基因;用LeadVH和RSCF引物进行第2轮PCR分别扩增重