斑点叉尾鮰天然fab噬菌体抗体库的构建

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1、斑点叉尾鲴天然Fab噬菌体抗体库的构建摘要噬菌体抗体库技术是近年来抗体技术研究中革命性的进展，利用此技术能够快速有效地制备人源化抗体，并且可以筛选到具有高亲和力的特异性抗体。目前此项技术在水产养殖业中尚未见报道，基于斑点叉尾鲴抗体基因研究比较清楚，本文构建了其天然噬菌体抗体库，具体工作如下：1引物设计斑点叉尾鲴重链可变区分为13个VH家族，针对每个Ⅷ家族设计1对特异性引物，共13对。轻链有两种类型，F链和G链，由于轻链基因序列同源性很高，因此每种类型设计1对引物，共2对。所有引物两端都带有限制性酶切位点，5’引物位于免

2、疫球蛋白可变区前导肽和N端第一骨架区(FRl)，3’位于CHl或CL末端。2轻链库的构建取50尾健康斑点叉尾鲴新鲜外周血共250mL，分离淋巴细胞，提取总RNA，经逆转录获得cDNA。PCR扩增抗体重链Fd和轻链基因片段，回收约650bp的抗体片段。将回收的PCR产物连接T载体(pT-Fd，pT-L)，分别用SacI+XbaI，SpeI+XhoI酶切，再次回收重链Fd和轻链基因片段。将第二次回收的轻链基因片段插入噬菌粒载体p3MH，重组后电转化大肠杆菌XLl．BLue，构建轻链库p3MH．L。取适量电转化后的菌液铺板培

3、养，统计转化子数，计算库容。经过多次转化轻链库库容达到5．10x107。随机挑取20个菌落，菌液PCR，电泳显示18个菌落可见约650bp的轻链基因条带，轻链库重组率为90％。将质粒p3MH．L经过SacI+XbaI酶切可见约650bp的插入片段，说明轻链库构建成功。3抗体库的构建将轻链库质粒p3MH．L经SpeI+XhoI双酶切，回收载体大片段(约4．1kb)，将其与第二次回收的重链Fd段基因连接，转化大肠杆菌，按构建轻链库的方法计算转化率和插入效率。经过4次转化最终得到总库容为5．67x107的抗体库(p3MH．L

4、．Fd)，插入效率为90％。抗体库质粒经XhoI单酶切，SpeI+XhoI双酶切后可见插入的目的片段，说明抗体库构建成功。4抗体库多样性分析将构建的抗体库菌液铺平皿后随机挑取单菌落，摇菌后测定重链Fd和轻链基因序列，进行序列对比，分析抗体库多样性。共测定lO条重链Fd段基因序列和6条轻链基因序列，结果显示扩增的Fd段和轻链基因结构完整，抗体多样性良好。关键词：噬菌体表面展示；斑点叉尾鲴；天然Fab抗体库；华中农业大学2009届硕士学位论文AbstractTheantibodyengineeringtechnologyh

5、asarevolutionaryadvancebyusingphageantibodylibraries．Itprovidesapowerfulmethodtoproducehumanizdmonoclonalantibodiesandcouldobtainantibodieswithhigheraffinity．TheFabphageantibodylibrariesofChannelcatfishwereconstructed，becausethebiochemicalinformationonstructurea

6、ndfunctionofchannelcatfishimmunogloblinshadbeenknownandtherewerenoreportsonthephageantibodylibraryinaquaculture．Theexperimentresultsasfollowing：1PrimerdesignInthecatfishVHgenesegmentsareorganizedinto13differentVHfamiliesforwhichwedesignedapairofprimers．Channelca

7、tfishhastwoclassesoflightchain(designatedFandG)whichhaveahighdegreeofsequencesimilarity,SOwedesignedtwopairsofprimers．Therewererestrictionenzymessitesonbothsidesoftheseprimers．The5'-primerswerecorrespondingtoregionswithintheleadersequenceorN-terminalFRregionand3

8、'-primerswerecorrespondingtotheCH1orCLregionsextremity．2ConstructionofthelightchainlibraryTotalRNAWasextractedfromtheperipheralbloodmononuclearcells(PBMCs)of50healthy