人抗┐hbsag fab段抗体的表达论文

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1、人抗┐HBsAgFab段抗体的表达论文.freelent;elecrophoresis，polyaylamideGeL;immunoblottingAbstract:AIMToobservetheexpressionoftheselectedantibodiesfromtheconstructedphagedisplaylibrary.METHODSTheexpressivevectorsofsolubleFabfragmententandHBsAg=0.2～0.4，加入IPTG至3mmolL-1，32℃培养过夜，离心收取上清.分别取制备好的未诱导和诱

2、导的蛋白样品在还原和非还原的条件下进行SDS-PAGE.样品经SDS-PAGE后电转移到硝酸纤维素膜上，用羊抗人IgG-Fab（Sigma）处理，NBT/BCIP（Promega）显色.用华美生物工程公司出品的抗-HBsAg的ELISA试剂盒，将菌体裂解物、阴性对照和阳性对照各50μL加入相应孔，每孔加酶标结合物50μL混匀，并且设对照孔.37℃反应20min，用清洗液洗5次后，加入显色剂37℃避光显色15min左右，观察结果.2结果2.1可溶性Fab段抗体在大肠杆菌中的表达含可溶性抗体质粒的菌株和仅含pb3H的菌株经IPTG诱导5h后，分别取菌体，冻

3、融细胞的上清做120gL-1SDS-PAGE.结果表明:在还原条件下出现Mr23×103的新的蛋白条带，而在非还原条件下出现Mr48×103左右的新的蛋白条带.和预期的结果一致（Fig1～3（略））.2.2免疫印迹实验噬菌体抗体借助单链噬菌体外壳蛋白Ⅲ将Fab段表达在噬菌体颗粒表面，用内切酶将基因Ⅲ片段从表达载体中除去，得到可溶性Fab段表达质粒［3］.转化大肠杆菌XL1-Blue后，经IPTG诱导后，取菌体，冻融细胞上清做r23×103的新的蛋白条带（Fig4（略）），而在非还原条件下出现Mr48×103左右的新的蛋白条带（Fig5（略））.和预期的

4、结果一致.2.3ELISA试验按上述步骤得到的抗体做ELISA鉴定.结果表明，所筛选到的阳性克隆与HB-sAg作用后均呈现反应（Fig6（略））.3讨论抗体库技术的出现，绕过了杂交瘤途径制备单克隆抗体，开创了抗体制备的新时代［4］.噬菌体抗体库技术与传统的杂交瘤技术相比具有明显的优越性:①简便易行，节省时间;②筛选的容量大;③抗体库技术直接得到抗体基因，避免了杂交瘤细胞克隆不稳定的缺点;④抗体库抗体可用原核细胞表达，无需组织培养，可大大降低单克隆抗体生产的成本.采用分泌表达载体.将抗体的轻链和重链在宿主菌的外周质中进行组装，证明，将Fab片段分泌到外周

5、质是表达和生产有功能的抗体片段的一个很好的策略.在外周质中的抗体片段之所以有功能，一个原因是外周质提供了适当的氧化环境，使蛋白折叠时能形成稳定的二硫键.除此之外，在折叠过程中Fd片段和轻链可以互为模板进行折叠.在本实验中我们分别取了菌体、冻融细胞的上清来做表达的研究.在还原的条件下，抗体Fd段和轻链之间的二硫键被打开，因此得到Mr23×103左右的条带.在非还原的条件下，由于未破坏抗体Fd段和轻链之间的二硫键，则出现了相对分子质量在48×103左右的条带.这个结果证明了可溶性Fab段的表达.在实验的过程中我们也发现了一个现象，载体未经诱导和诱导后有时均

6、出现有表达的情况，我们推测可能的原因是所用的载体是pb3经改造而来的，它把抗体轻链和重链的表达置于同一个操纵子下，可能存在操纵子调控上的问题，至于确定的原因有待于进一步的探讨.在获得了可溶性Fab段抗体表达载体后，我们又进行了一次ELISA实验，结果表明我们获得的是对HBsAg的特异性的抗体.