鼠抗人ctni单克隆抗体fab段基因克隆和序列分析的论文

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　　鼠抗人cTnI单克隆抗体Fab段基因克隆和序列分析的论文作者：李妍妍，杨笛，卞智萍，徐晋丹，陈相健，顾春荣，张寄南【摘要】目的：克隆鼠抗人ctnimabfab段基因并进行序列分析.方法：设计扩增鼠igg重链fd段及κ轻链引物，从分泌ctnimab的杂交瘤细胞中提取总rna，rtpcr扩增，对扩增产物进行分子克隆、测序及序列分析.结果：重链和轻链引物分别扩增出一约700bp和800bpdna片段.经序列分析，与已发表的鼠igg基因序列对比，其核苷酸及其所推导的氨基酸序列符合鼠igg1fab段特征.在genbank登录，登录号为ay484430（重链）,ay484431（轻链）;氨基酸序列登录号为aar83243（重链）,aar83244（轻链）.结论：本实验室获得了完整的鼠源性抗人ctnimabfab段基因，为鼠抗人ctni的人源化改造奠定了基础.【关键词】抗体，单克隆；基因；序列分析；血清心肌钙蛋白　　【abstract】aim:toobtainthegeneofmurineantictnifabfragmentandanalysethenucleotideanddeducedaminoacidsequences.methods:byrtpcrmethod,thecdnaofantictnimurineantibodyfabfragmentplifiedfromthehybridomacells.cloningandsubsequentsequenceanalysisofthefabfragmented.thededucedaminoacidsequenceate700and800basepairsplifiedusingiggheavychainprimersandκlightchainprimers,respectively.sequenceanalysisindicatedthatthededucedaminoacidsequencesinoacidpresentinthemurineigg1fabfragment(genbankaccessionnoay484430,ay484431;proteinbankaccessionnoaar83243,aar83244).conclusion:thecloningandsequencingofapletemurineantictnifabfragmentprovidesabasisfortheproductionofthechimericantictniantibody.　　【keyonocolonal;genes;sequenceanalysis;cardiactroponini　　0引言 　　本室已有多株高特异高表达的鼠源性抗人ctni细胞株，用来检测心肌损伤时外周血中ctni水平高低，显示了较高的临床诊断价值［1-4］.但由于鼠源性mab的人抗鼠抗体反应［5］，使之不能用于体内诊断及作为治疗心肌损伤的药物载体，所以必须对其进行人源化修饰，有关鼠源性抗人ctni的人源化改造少见报道.本研究目的是将鼠源性抗ctni抗体fab段基因克隆出来并进行序列分析，为下一步制备嵌合抗体打下基础.　　1材料和方法　　1.1材料杂交瘤细胞株1株（js200202），大肠杆菌e.colidh5α由本室保存.pmd18t载体购自takara公司.taqdna聚合酶，amv逆转录酶（promega公司）；iptg(异丙基βd半乳糖苷)，xgal(5溴4氯3吲哚半乳糖苷)为上海生物工程公司产品.质粒小量抽提试剂盒为上海华舜生物工程公司产品，g03sl离心式高纯质粒大量抽提试剂盒为上海申能博彩生物科技有限公司产品.　　1．2方法　　1．2．1pcr引物设计根据已发表的小鼠fab段的fd基因和轻链基因、fr1和第一恒定区3′端的保守的基因序列，设计扩增fd基因和轻链基因的5′端和3′端引物.重链fd段5′端引物：h1:5′sakgtgcagctcgagsagtcaggacct3′；h2:5′gaggtycagctcgaacartctggacct3′；h3:5′caggtccaactcgagcagyctgggkct3′；h4:5′gaggttcagctcgagcagtctggrgcagctcgaggagtctggggga3′；轻链基因的5′端引物1：5′cctctagagacatccagatgamccagtctcc3′；2：5′cctctagagacatyktgctgacycartctcc3′；3：5′cctctagaracattgtratgacmcartctcc3′；4：5′cctctagagacatycagmtgacycagtctcc3′；5：5′cctctagaggagacattgtgatgacccagtc3′；6：5′cctctagagatattgtgmtaacycagkmtsmasyc3′；7：5′cctctagagatatcscagc3′；8：5′cctctagagctgttgtgrtgacycaaactcc3′；9：5′cctctagagatgttktgatgacccamactcc3′；10：5′cctctagagatgttttgatgamccaaaytcc3′；11：5′cctctagagaraatstgctcacccagtctcc3′；12：5′cctctagasaaattgttctcacccagtctcc3′；13：5′cctctagacaggctgttgtgactcaggaatc3′;重链fd段3′端引物igg1：5′aggcttactagtacaatccctgggcacaat3′;igg2b：5′ctc cttactagtaggacaggggttgattgt3′;igg3：5′gggggtactagtcttgggtattctaggctc3′;轻链基因3′端引物：5′gcgccgtctagaattaacactcattcctgttgaa3′.以上s=c/g，y=c/t，m=a/c，abctni的杂交瘤细胞中，用异硫氰酸胍法从5×107杂交瘤细胞中提取总rna.　　1．2．3rtpcr扩增及其产物克隆以oligodt9为引物逆转录合成cdna.以合成的cdna为模板，用上述上下游引物分别两两配对，进行pcr，扩增出fab段的重、轻链基因片段.重链fd段pcr反应条件为：94℃变性45s，57℃退火45s，72℃延伸60s，35个循环，最后72℃延伸5min；轻链反应条件为：94℃预变性10min,94℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环，最后72℃延伸10min.回收扩增的fd和轻链基因，分别插入pmd18t载体中，取t载体0.5μl，回收的fd或轻链基因4.5μl，ligationsolution15μl，总反应体积10μl，16℃过夜反应.取4μl连接反应液转化e.colidh5α菌［6］.利用蓝、白斑筛选，菌落pcr鉴定重组质粒.　　1．2．4菌落pcr鉴定目的基因片段插入引物序列为t载体的测序引物：上游引物（sequencingprimerrvm）：5′gagcggataacaatttcacacagg3′，下游引物（sequencingprimerm1347）：5′cgccagggttttcccagtcacgac3′，pcr反应条件为：94℃预变性10min，94℃变性1min,52℃退火2min，72℃延伸2min，30个循环，最后72℃延伸10min.取10μl的反应体积以13g/l琼脂糖凝胶电泳鉴定pcr产物.电泳照片经计算机图像分析软件quantityone处理.　　1．2．5dna序列测定与分析将dna样品及抽提的重组质粒送大连宝生物制品有限公司，经ab1310全自动测序仪进行序列测定.用dnaman和blast软件分析所测序列.　　2结果　　2．1rna提取和rtpcr扩增的目的基因片段及测序从分泌mabctni抗体的杂交瘤细胞系js200202中提取总rna，紫外分光光度计a260nm/a280nm>1.9,说明提取的rna纯度很高.h1,h4,h5,h7上游引物与下游引物igg1扩增出800bp左右片段；h3扩增出400bp左右片段；h2,h6未见片段扩出（图1）.下游引物igg2b，igg3与所有上游引物配对均未见片段扩出.测序报告证实h1，h4，h5，h7引物扩增的重链fd段基因具有同源性.图2, 3为轻链pcr扩增电泳图，将扩出的所有片段进行测序，表明l13引物扩增出700bp左右片段为抗体序列片段，其余为非抗体序列片段.　　m：dl2000marker;1～7∶1～7对上游引物扩增的重链pcr产物.　　图1重链fd琼脂糖凝胶电泳（略）　　m：dl2000marker;1～5∶1～5对上游引物扩增的重链pcr产物.　　图21～5对上游引物扩增的轻链pcr产物电泳（略）　　2.2转化感受态细菌选取h1和l13的pcr产物作连接反应，转化感受态细胞，可以看到重链和轻链组分布均匀的蓝白菌落，二者比例约为1∶1，白色菌落均有20余个，对重链、轻链分别挑取16个菌落.　　2．3菌落pcr电泳可见重链800bp左右的片段，可见轻链700bp左右的片段（图4，5），证明有目的片段插入t载体中.用小量质粒抽提试剂盒将质粒抽提出来，送至takara公司测序.　　2.4重组质粒的插入片段测序报告［7-9］genbank登录号分别为ay484430，ay484431.轻链第23位和第93位亦为骨架区的两个半胱氨酸（cys）.上述获得的抗体fab段基因即是杂交瘤细胞正常表达的抗人ctni单抗基因,为igg1亚型.网上核对vbase数据库，重链可变区属于vh3家族，j段来源于jh3a，轻链可变区属于vkⅱ亚类（subgroupⅱ），j段来源于jk2.　　m：dl2000marker；1～8∶6～13对上游引物扩增的轻链pcr产物.　　图36～13对上游引物扩增的轻链pcr产物电泳（略）　　m：dl2000 marker;1，6，8，9：未插入重链fd段的pcr产物；2～5，7：插入重链fd段的pcr产物.　　图4重链片段的菌落pcr琼脂糖凝胶电泳（略）　　m：dl2000marker;1～4，6～13，15，16：插入轻链片段的pcr产物；5，14：未插入轻链片段的pcr产物.　　图5轻链片段的菌落pcr琼脂糖凝胶电泳（略）　　3讨论　　由于本实验室已有能分泌mabctni的杂交瘤细胞系，因此，我们首先合成若干对通用引物，用rtpcr技术，将抗ctni抗体的fab段基因扩增出来，测序，经inter网(网址：/kaoshiruanjian/"target="_blank"title="">软件分析，得到氨基酸序列的编码框，中间都没有中止密码.目前国内外尚未见抗ctni抗体基因序列相关报道.在本实验中所得到的重链和轻链的基因序列已经被美国国立医学图书馆的免疫球蛋白数据库收录，登录号分别为ay484430，ay484431.抗人ctni抗体的fab段基因的克隆及序列分析为抗人ctni嵌合抗体的真核蛋白表达打下基础.【参考文献】　　［1］张寄南，杨国平，苏恩本,等.血清肌钙蛋白i诊断急性心肌梗塞的研究［j］，中华心血管病杂志，1997,25(5),379-382.　　［2］张寄南，苏恩本，魏瑾,等.血清肌钙蛋白i升高与病毒性心肌炎诊断及病程关系探讨［j］，中华心血管病杂志，1999,27(6),421-424.　　［3］nageht,sher,etal.cardiactroponiniforriskstratificationfolloes［j］.cathetercardiovascinterv,2001,55(1),37-42.　　［4］mithscjr,blairsn,bono,antibodyhumanization:acaseofthe‘emperorsnemunoltoday,2000，21(8):397-402.　　［6］sambrookj,fritschef,maniatist.molecularcloning:alaboratorymanual［m］,3th.usa:coldspringharborlaboratorypress,2001:96. 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