抗cd45单克隆抗体可变区基因的克隆与序列分析

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1、·独创性声明本人郑重声明，本学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果的总结。尽我所知，除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本人将承担本声明引起的一切法律后果。学位论文作者签名：日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权华中科技大学可

2、以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密?，在_____年解密后适用本授权书。本论文属于不保密?。（请在以上方框内打“v”）学位论文作者签名：杨娟指导教师签名：沈关心教授日期：年月日日期：年月日····华中科技大学硕士学位论文（2008）抗CD45单克隆抗体可变区基因的克隆及序列分析硕士研究生：杨娟导师：沈关心教授华中科技大学同济医学院基础医学院免疫学教研室中文摘要目的抗CD45单克隆抗体可变区基因的克隆及序列分析，为进一步的基因工程抗

3、体改造研究奠定基础。方法1.杂交瘤细胞总RNA的提取：以异硫氰酸胍－苯酚－氯仿法提取总RNA。2.引物的设计：利用V区N端相对保守的特点，根据Ig可变区的序列，在N端和恒定区CH1合成5’和3’端兼并的“通用”引物。3.McAbV区基因的扩增：以RNA为模板，采用cDNA合成试剂盒合成第一条链cDNA，以cDNA为模板，用TaqDNA酶扩增McAbV区基因。4.V区基因核苷酸序列分析：用胶回收试剂盒回收PCR产物后，将McAb的VH基因和VL基因分别与pGEM-T载体连接，并转化大肠杆菌，经菌落PCR鉴定阳性

4、菌。每一种连接产物挑取3个阳性菌进行序列分析。5.利用DNAtools，IMGT/QUEST及EBITOOLS:ClustalW2分析软件对轻链和重链基因分别进行同源性比较。结果1.第一次PCR用2条重链上游引物（MH1,MH2），一条下游引物（IgG1-C3’）；轻2····华中科技大学硕士学位论文（2008）链上(MK)下(Kc)游各一条引物进行扩增，测序结果获得编码单克隆抗体可变区的核苷酸序列。含引物的VH长397bp，VL长377bp，此次扩增出的基因序列无信号肽序列，适于ScFv的构建，进一步以更换

5、引物进行二次PCR，来扩增含信号肽序列的基因。2.第二次PCR用3条重链上游（VH5’1，2，3），一条下游引物（IgG1-C3’）；3条轻链上游（VL5’1，2，3）引物,下游引物(Kc)进行扩增，测序结果：VH为有功能的基因片段,长348bp，编码116个氨基酸，在VH前有57bp的信号肽序列，编码19个氨基酸；含引物的V?长369bp，扩增的为非功能性V?链。经分析发现扩增出非功能轻链的上游引物为VL5’1，为了扩增出有功能的轻链基因，需重新设计引物。3.第三次PCR用新合成的VL5’4，5取代原轻链上

6、游引物VL5’1，用4条轻链上游引物（VL5’2，3，4，5），新合成下游引物（VL3’1），扩增出的V?核苷酸序列长333bp，编码111个氨基酸，在V?前有57bp的信号肽序列，编码19个氨基酸，经IMGT/QUEST系统分析为有功能的轻链基因。对所扩增的Ig基因进行同源性比较结果：抗CD45单抗有功能的轻链均属于IG?V1-117’01家族；功能性重链属于IGHV2-9-1’01家族。其中扩增出的非功能的轻链属于IG?V3-12’01家族。结论成功获取抗CD45单抗的轻链与重链基因，以及含有信号肽的基因

7、，为进一步通过基因工程技术改造抗体奠定了良好的基础。关键词单克隆抗体；VH，VL基因克隆；序列分析；3····华中科技大学硕士学位论文（2008）CloningofAnti-CD45MonoclonalAntibodyandAnalysisofTheirSequencesAbstractObjectiveTocloneanti-CD45monoclonalantibodyvariableregiongenefragmentsandanalysistheirsequences,laythefurtherfoun

8、dationformodificationofgeneengineeringantibodiesstudy.Methods1.TotalRNAextractionfromhybridomacell:useguanidineisothiocyanate-phenol-chloroformtoextractthetotalRNA.2.Primerdesign:cloninghumanandmouseIg