鼠抗人ctni单克隆抗体fab段基因克隆和序列分析

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鼠抗人cTnI单克隆抗体Fab段基因克隆和序列分析公文易文秘资源网　佚名　2008-10-140:33:41　我要投稿　添加到百度搜藏提取的RNA纯度很高.H1,H4,H5,H7上游引物与下游引物IgG1扩增出800bp左右片段；H3扩增出400bp左右片段；H2,H6未见片段扩出（图1）.下游引物IgG2b，IgG3与所有上游引物配对均未见片段扩出.测序报告证实H1，H4，H5，H7引物扩增的重链Fd段基因具有同源性.图2,3为轻链PCR扩增电泳图，将扩出的所有片段进行测序，表明L13引物扩增出700bp左右片段为抗体序列片段，其余为非抗体序列片段.　　M：DL2000marker;1～7∶1～7对上游引物扩增的重链PCR产物.　　图1重链Fd琼脂糖凝胶电泳（略）　　M：DL2000marker;1～5∶1～5对上游引物扩增的重链PCR产物.　　图21～5对上游引物扩增的轻链PCR产物电泳（略）　　2.2转化感受态细菌选取H1和L13的PCR产物作连接反应，转化感受态细胞，可以看到重链和轻链组分布均匀的蓝白菌落，二者比例约为1∶1，白色菌落均有20余个，对重链、轻链分别挑取16个菌落.　　2．3菌落PCR电泳可见重链800bp左右的片段，可见轻链700bp左右的片段（图4，5），证明有目的片段插入T载体中.用小量质粒抽提试剂盒将质粒抽提出来，送至TaKaRa公司测序.　　2.4重组质粒的插入片段测序报告［7-9］GenBank登录号分别为AY484430，AY484431.轻链第23位和第93位亦为骨架区的两个半胱氨酸（Cys）.上述获得的抗体Fab段基因即是杂交瘤细胞正常表达的抗人cTnI单抗基因,为IgG1亚型.网上核对V BASE数据库，重链可变区属于VH3家族，J段来源于JH3a，轻链可变区属于VKⅡ亚类（SubgroupⅡ），J段来源于JK2.　　M：DL2000marker；1～8∶6～13对上游引物扩增的轻链PCR产物.　　图36～13对上游引物扩增的轻链PCR产物电泳（略）　　M：DL2000marker;1，6，8，9：未插入重链Fd段的PCR产物；2～5，7：插入重链Fd段的PCR产物.　　图4重链片段的菌落PCR琼脂糖凝胶电泳（略）　　M：DL2000marker;1～4，6～13，15，16：插入轻链片段的PCR产物；5，14：未插入轻链片段的PCR产物.　　图5轻链片段的菌落PCR琼脂糖凝胶电泳（略）　　3讨论　　由于本实验室已有能分泌mAbcTnI的杂交瘤细胞系，因此，我们首先合成若干对通用引物，用RTPCR技术，将抗cTnI抗体的Fab段基因扩增出来，测序，经Internet网(网址：www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast)［7］核实，发现H1，H5，H73种引物扩增出来的重链序列具有同源性，为同一序列；在轻链基因克隆中，获得一个无功能的轻链产物，它来自杂交瘤亲代细胞之一骨髓瘤细胞SP2/0.有关该骨髓瘤细胞分泌轻链的全序列已见报道，最突出的特点是其轻链基因的第23位氨基酸是酪氨酸（Tyr），而不是真正杂交瘤细胞所分泌轻链的半胱氨酸（Cys）.如L25，L610等上游引物扩增出来的cDNA片段，均为这种无功能的轻链产物.L1，L11,L12等上游引物扩增出来的cDNA片段测序，经核实证明，缺失FR1和CDR1功能区.唯有L13上游引物扩增出来的700 bp的cDNA片段为有功能的轻链基因产物.为得到完整的Fab段基因序列，取H1和L13引物PCR产物做TA克隆.测序结果用BLAST和DNAman软件分析，得到氨基酸序列的编码框，中间都没有中止密码.目前国内外尚未见抗cTnI抗体基因序列相关报道.在本实验中所得到的重链和轻链的基因序列已经被美国国立医学图书馆的免疫球蛋白数据库收录，登录号分别为AY484430，AY484431.抗人cTnI抗体的Fab段基因的克隆及序列分析为抗人cTnI嵌合抗体的真核蛋白表达打下基础.【参考文献】　　［1］张寄南，杨国平，苏恩本,等.血清肌钙蛋白I诊断急性心肌梗塞的研究［J］，中华心血管病杂志，1997,25(5),379-382.　　［2］张寄南，苏恩本，魏瑾,等.血清肌钙蛋白I升高与病毒性心肌炎诊断及病程关系探讨［J］，中华心血管病杂志，1999,27(6),421-424.　　［3］NagehT,SherwoodRA,HarrisBM,etal.CardiactroponinIforriskstratificationfollowingpercutaneouscoronaryarteryinterventioninacutecoronarysyndromes［J］.CatheterCardiovascInterv,2001,55(1),37-42.　　［4］mithSCJr,BlairSN,BonowRO,etal.AHA/ACCGuidelinesforPreventingHeartAttackandDeathinPatientsWithAtheroscleroticCardiovascularDiseaseAKGTGCAGCTCGAGSAGTCAGGACCT3′；H2:5′GAGGTYCAGCTCGAACARTCTGGACCT3′；H3:5′CAGGTCCAACTCGAGCAGYCTGGGKCT3′；H4:5′GAGGTTCAGCTCGAGCAGTCTGGRGCWG3′；H5:5′GARGTGAAGCTCGAAGAGWCTGGASGA3′；H6:5′GAGGTGAAGCTTCTCGACTCTGGAGGT3′；H7:5′GAAGTGMAGCTCGAGGAGTCTGGGGGA3′ ；轻链基因的5′端引物1：5′CCTCTAGAGACATCCAGATGAMCCAGTCTCC3′；2：5′CCTCTAGAGACATYKTGCTGACYCARTCTCC3′；3：5′CCTCTAGARACATTGTRATGACMCARTCTCC3′；4：5′CCTCTAGAGACATYCAGMTGACYCAGTCTCC3′；5：5′CCTCTAGAGGAGACATTGTGATGACCCAGTC3′；6：5′CCTCTAGAGATATTGTGMTAACYCAGKMTSMASYC3′；7：5′CCTCTAGAGATATCSWKATGACMCAGWCTMC3′；8：5′CCTCTAGAGCTGTTGTGRTGACYCAAACTCC3′；9：5′CCTCTAGAGATGTTKTGATGACCCAMACTCC3′；10：5′CCTCTAGAGATGTTTTGATGAMCCAAAYTCC3′；11：5′CCTCTAGAGARAATSTGCTCACCCAGTCTCC3′；12：5′CCTCTAGASAAATTGTTCTCACCCAGTCTCC3′；13：5′CCTCTAGACAGGCTGTTGTGACTCAGGAATC3′;重链Fd段3′端引物IgG1：5′AGGCTTACTAGTACAATCCCTGGGCACAAT3′;IgG2b：5′CTCCTTACTAGTAGGACAGGGGTTGATTGT3′;IgG3：5′GGGGGTACTAGTCTTGGGTATTCTAGGCTC3′;轻链基因3′端引物：5′GCGCCGTCTAGAATTAACACTCATTCCTGTTGAA3′.以上S=C/G，Y=C/T，M=A/C，W=A/T，K=T/G，r=A/G，由TaKaRa公司合成.　　1．2．2细胞总RNA提取从生长良好、能分泌mAbcTnI的杂交瘤细胞中，用异硫氰酸胍法从5×107杂交瘤细胞中提取总RNA.　　1．2．3RTPCR扩增及其产物克隆以OligodT9为引物逆转录合成cDNA.以合成的cDNA为模板，用上述上下游引物分别两两配对，进行PCR，扩增出Fab段的重、轻链基因片段.重链Fd段PCR反应条件为：94℃变性45s，57℃退火45s，72℃延伸60s，35个循环，最后72℃延伸5min；轻链反应条件为：94℃预变性10min,94℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环，最后72℃延伸10min.回收扩增的Fd和轻链基因，分别插入pMD18T载体中，取T载体0.5μL，回收的Fd或轻链基因4.5μL，Ligation Solution15μL，总反应体积10μL，16℃过夜反应.取4μL连接反应液转化E.coliDH5α菌［6］.利用蓝、白斑筛选，菌落PCR鉴定重组质粒.　　1．2．4菌落PCR鉴定目的基因片段插入引物序列为T载体的测序引物：上游引物（SequencingPrimerRVM）：5′GAGCGGATAACAATTTCACACAGG3′，下游引物（SequencingPrimerM1347）：5′CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC3′，PCR反应条件为：94℃预变性10min，94℃变性1min,52℃退火2min，72℃延伸2min，30个循环，最后72℃延伸10min.取10μL的反应体积以13g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物.电泳照片经计算机图像分析软件QuantityOne处理.　　1．2．5DNA序列测定与分析将DNA样品及抽提的重组质粒送大连宝生物制品有限公司，经AB1310全自动测序仪进行序列测定.用DNAMAN和BLAST软件分析所测序列.　　2结果　　2．1RNA提取和RTPCR扩增的目的基因片段及测序从分泌mAbcTnI抗体的杂交瘤细胞系JS200202中提取总RNA，紫外分光光度计A260nm/A280nm>1.9,说明提取的RNA纯度很高.H1,H4,H5,H7上游引物与下游引物IgG1扩增出800bp左右片段；H3扩增出400bp左右片段；H2,H6未见片段扩出（图1）.下游引物IgG2b，IgG3与所有上游引物配对均未见片段扩出.测序报告证实H1，H4，H5，H7引物扩增的重链Fd段基因具有同源性.图2,3为轻链PCR扩增电泳图，将扩出的所有片段进行测序，表明L13引物扩增出700bp左右片段为抗体序列片段，其余为非抗体序列片段.　　M：DL2000marker;1～7∶1～7对上游引物扩增的重链PCR产物.　　图1重链Fd琼脂糖凝胶电泳（略）　　M：DL2000marker;1～5∶1～5对上游引物扩增的重链PCR产物. 　　图21～5对上游引物扩增的轻链PCR产物电泳（略）　　2.2转化感受态细菌选取H1和L13的PCR产物作连接反应，转化感受态细胞，可以看到重链和轻链组分布均匀的蓝白菌落，二者比例约为1∶1，白色菌落均有20余个，对重链、轻链分别挑取16个菌落.　　2．3菌落PCR电泳可见重链800bp左右的片段，可见轻链700bp左右的片段（图4，5），证明有目的片段插入T载体中.用小量质粒抽提试剂盒将质粒抽提出来，送至TaKaRa公司测序.　　2.4重组质粒的插入片段测序报告［7-9］GenBank登录号分别为AY484430，AY484431.轻链第23位和第93位亦为骨架区的两个半胱氨酸（Cys）.上述获得的抗体Fab段基因即是杂交瘤细胞正常表达的抗人cTnI单抗基因,为IgG1亚型.网上核对VBASE数据库，重链可变区属于VH3家族，J段来源于JH3a，轻链可变区属于VKⅡ亚类（SubgroupⅡ），J段来源于JK2.　　M：DL2000marker；1～8∶6～13对上游引物扩增的轻链PCR产物.　　图36～13对上游引物扩增的轻链PCR产物电泳（略）　　M：DL2000marker;1，6，8，9：未插入重链Fd段的PCR产物；2～5，7：插入重链Fd段的PCR产物.　　图4重链片段的菌落PCR琼脂糖凝胶电泳（略）　　M：DL2000marker;1～4，6～13，15，16：插入轻链片段的PCR产物；5，14：未插入轻链片段的PCR产物.　　图5轻链片段的菌落PCR琼脂糖凝胶电泳（略） 　　3讨论　　由于本实验室已有能分泌mAbcTnI的杂交瘤细胞系，因此，我们首先合成若干对通用引物，用RTPCR技术，将抗cTnI抗体的Fab段基因扩增出来，测序，经Internet网(网址：www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast)［7］核实，发现H1，H5，H73种引物扩增出来的重链序列具有同源性，为同一序列；在轻链基因克隆中，获得一个无功能的轻链产物，它来自杂交瘤亲代细胞之一骨髓瘤细胞SP2/0.有关该骨髓瘤细胞分泌轻链的全序列已见报道，最突出的特点是其轻链基因的第23位氨基酸是酪氨酸（Tyr），而不是真正杂交瘤细胞所分泌轻链的半胱氨酸（Cys）.如L25，L610等上游引物扩增出来的cDNA片段，均为这种无功能的轻链产物.L1，L11,L12等上游引物扩增出来的cDNA片段测序，经核实证明，缺失FR1和CDR1功能区.唯有L13上游引物扩增出来的700bp的cDNA片段为有功能的轻链基因产物.为得到完整的Fab段基因序列，取H1和L13引物PCR产物做TA克隆.测序结果用BLAST和DNAman软件分析，得到氨基酸序列的编码框，中间都没有中止密码.目前国内外尚未见抗cTnI抗体基因序列相关报道.在本实验中所得到的重链和轻链的基因序列已经被美国国立医学图书馆的免疫球蛋白数据库收录，登录号分别为AY484430，AY484431.抗人cTnI抗体的Fab段基因的克隆及序列分析为抗人cTnI嵌合抗体的真核蛋白表达打下基础.【参考文献】　　［1］张寄南，杨国平，苏恩本,等.血清肌钙蛋白I诊断急性心肌梗塞的研究［J］，中华心血管病杂志，1997,25(5),379-382.　　［2］张寄南，苏恩本，魏瑾,等.血清肌钙蛋白I升高与病毒性心肌炎诊断及病程关系探讨［J］，中华心血管病杂志，1999,27(6), 421-424.　　［3］NagehT,SherwoodRA,HarrisBM,etal.CardiactroponinIforriskstratificationfollowingpercutaneouscoronaryarteryinterventioninacutecoronarysyndromes［J］.CatheterCardiovascInterv,2001,55(1),37-42.　　［4］mithSCJr,BlairSN,BonowRO,etal.AHA/ACCGuidelinesforPreventingHeartAttackandDeathinPatientsWithAtheroscleroticCardiovascularDisease:2001Update［J］.Circulation,2001,104:1577-1579.　　［5］ClarkM,Antibodyhumanization:acaseofthe‘Emperorsnewclothes’［J］?ImmunolToday,2000，21(8):397-402.　　［6］SambrookJ,FritschEF,ManiatisT.MolecularCloning:alaboratorymanual［M］,3th.USA:ColdSpringHarborLaboratoryPress,2001:96.　　［7］AltschulA,StephenF,ThomasL.etal.GappedBLASTandPSIBLAST:anewgenerationofproteindatabasesearchprograms［J］.NucleicAcidsRes,1997，25:3389-3402.　　［8］MacCallumRM,MartinACR,ThorntonJT.Antibodyantigeninteractions:Contactanalysisandbindingsitetopography［J］.JMolBiol,1996，262（5）：732-774.　　［9］CorbettSJ,TomlinsonIM,SonnhammerEL,etal.Sequenceofthehumanimmunoglobulindiversity(D)segmentlocus:asystematicanalysisprovidesnoevidencefortheuseofDIRsegments,invertedDsegments,“minor”DsegmentsorDDrecombination［J］.JMolBiol,1997，270（4）,587-597.鼠抗人TCR/CD3单克隆抗体的制备及其初步应用公文易文秘资源网　佚名　2009-2-118:19:53　我要投稿　添加到百度搜藏作者：陈宏远,芮雯,花文峰，杜军,蔡绍晖【摘要】目的应用B淋巴细胞杂交瘤技术，制备鼠抗人CD3单克隆抗体，并用于T淋巴细胞亚类检测作者：陈宏远,芮雯,花文峰，杜军,蔡绍晖 【摘要】目的应用B淋巴细胞杂交瘤技术，制备鼠抗人CD3单克隆抗体，并用于T淋巴细胞亚类检测。方法以本室纯化的CD3蛋白免疫Balb/c小鼠，取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，成功地获得1株抗人CD3单克隆抗体。经间接ELISA测定，杂交瘤细胞培养腹水的抗体效价。结合SDSPAGE实验考察单克隆抗体对CD3促T淋巴细胞增殖活性的作用。结果杂交瘤细胞培养腹水的抗体含量为20mg/mL，效价为10-7，并对T淋巴细胞有促增殖活性，检测正常人外周血阳性T细胞百分率为(73±7)％。结论制备的抗人CD3单克隆抗体具备较高的纯度和活性，可用于T细胞亚类的检测。【关键词】CD3；单克隆抗体；杂交瘤Abstract:ObjectiveTodetecttheCD3positiveTlymphocytessubgroupwiththemonoclonalantibodyofmouseantihumanCD3antigenofTlymphocytewhichproducedbyBlymphocytehybridomatechnique.MethodsBalb/cmicewereimmunizedwithCD3proteinproducedinourlaboratory,mixedSP2/0myelomawithspleencellsofthemice,thenobtainedanantihumanCD3antigenofhybridomacellline.TheasciticculturemonoclonalantibodytiterwasdeterminedbyindirectELISA,thequantityandmolecularweightweredeterminedbySDSPAGE.MTTmethodwascontributedtoexploreitsactivityofpromotingTlymphocyteproliferation.ResultsThemonoclonalantibodyquantityofascitichybridomacellwas20mg/mLandthetiterwas10-7.IthadanactivityofpromotingTlymphocyteproliferation,percentageofTlymphocyteinhealthyadultperipheralbloodsampleswas(73±7)％.ConclusionThisresultssuggestthattheantiCD3monoclonalantibodyhadhighpurityandactivitythatmightbeusedinthedetectionofCD3positiveTlymphocytessubgroup,andcouldbeappliedinTlymphocytedetection.Keywords:CD3;monoclonalantibody;hybridomas CD3是T淋巴细胞的一个分化抗原，表达于所有成熟T细胞表面，它是由5条肽链非共价结合组成的复合分子，分别称为γ、δ、ε、ζ和η链。其与TCR分子以非共价结合形成一个TCR/CD3复合受体分子，其中TCR是识别异种抗原和自身MHC分子多态性决定族的受体，而CD3分子并不参与抗原识别，它具有稳定TCR结构和传递活化信号的作用。TCR/CD3复合体是T细胞功能和特异性的主要调节者，抗TCR/CD3单克隆抗体已在基础研究和临床中都被广泛应用。如何制备质量好、产量高的单克隆抗体是当前各有关实验室研究的重要问题。目前用于生产单克隆抗体的方法有2种：利用纯系小鼠生产免疫腹水法和杂交瘤细胞常规体外培养法［1,2］。鉴于本次试验样品备用于后续的研发，以及腹水法易保持生物学活性、耗时短和易操作等优点，故应用B淋巴细胞杂交瘤技术联合腹水法，制备并筛选了1株抗人CD3单克隆抗体，并对其特性进行了鉴定和检测，获得较为满意的结果，现报道如下。1材料与方法1.1材料1.1.1纯化抗原、抗体与试剂/盒CD3抗原利用基因重组技术制备，由本室纯化并提供。鼠抗人CD3单克隆抗体及羊抗鼠IgG抗体,APAAPKit为Sigma公司产品，50％(φ)聚乙二醇（PEG,MW1500）等其余细胞融合、免疫检测、分离纯化和SDSPAGE电泳试剂，均为进口或进口分装分析纯产品。1.1.2细胞株及细胞培养液小鼠骨髓瘤细胞（SP2/0细胞系）由中山大学药学院分子生物学实验室保存，7周龄SPF级BALB/c小鼠购自中山大学实验动物中心，许可证号：粤监证字2004A084；完全RPMI1640培养液（含10％新生小牛血清）、无血清RPMI1640培养液、HAT培养液和HT培养液由Gibico公司提供。1.2方法 1.2.1免疫小鼠和骨髓瘤细胞准备将CD3纯品的蛋白浓度调整为1mg/mL,取0.4mL与等量的福氏完全佐剂混合、乳化,注射于Balb/C小鼠腹腔，每只小鼠0.2mL。2周后，同样剂量的CD3与等量的福氏不完全佐剂混合、乳化,加强免疫。融合前3d，尾静脉注射100μgCD3蛋白。将小鼠骨髓瘤细胞用完全RPMI1640培养液在培养瓶中进行扩大培养。选择生长旺盛、活力大于95％的骨髓瘤细胞，收集于50mL离心管中，1000r/min离心15min。弃上清液，沉淀细胞用无血清RPMI1640培养液洗涤2次，1000r/min离心15min。用无血清RPMI1640培养液重悬末次沉淀细胞，计数活细胞，配成1×106细胞/mL，以备融合使用。1.2.2免疫小鼠脾细胞悬液的制备无菌条件下取免疫小鼠脾脏，置培养皿中的200目不锈钢网上。加少量无血清RPMI1640培养液，用注射器平端将脾脏轻轻压过钢网，取出钢网，用滴管轻轻吹吸分散细胞。再以RPMI1640培养液洗涤一次，1000r/min离心10min。沉淀细胞重悬于50mL无血清RPMI1640培养液，计数淋巴细胞，以备融合使用。1.2.3细胞融合取制备好的骨髓瘤细胞与脾淋巴细胞，以1∶8比例在50mL离心管中混合，1000r/min离心10min。弃尽上清，轻轻叩松留存管内的沉淀细胞。将细胞、50％PEG及无血清RPMI1640培养液均置于37℃水浴箱中预温。将50％PEG0.8mL于1min内逐滴加入细胞沉淀中，37℃水浴箱中静置1min。逐渐加入预温的无血清RPMI1640培养液30mL,轻轻摇动试管，5min内加完。在室温中以1000r/min离心10min。弃上清，沉淀细胞用10mL含小牛血清的HAT培养液重新悬浮。滴加于预先铺有饲养细胞的96孔培养板中，每孔100μL。置37℃、5％CO2孵箱培养。1.2.4杂交瘤细胞的克隆化采用有限稀释法。于96孔平底微量培养板制备巨噬细胞培养层［3］，用一块板作阳性孔杂交瘤细胞的克隆化。收集并计数各阳性孔中的细胞。分别制备细胞数目为20、10、5/mL的细胞悬液。分别加入96孔培养板，每孔100μL。培养板置37 ℃、5％CO2孵箱培养。1～2周可观察到克隆生长。检测上清中的抗体，将阳性孔中杂交瘤细胞再次选出培养并作克隆化。1.2.5杂交瘤细胞系的建立与维持每只小鼠腹腔内注射0.5mL降植烷。7d后于小鼠腹腔内注射1×106杂交瘤细胞，2周后大多数可产生实体瘤和腹水。用注射器抽出腹水，在4℃以2000r/min离心15min，备用腹水冻存于-70℃。小鼠存活期间可重复上述最后一步。1.2.6单克隆抗体的提取与纯化［4］取上述收获的腹水加等量PBS，于搅拌下逐滴加入等体积的饱和硫酸铵。冰浴30min，2500r/min,30min，使其充分沉淀。将所得沉淀物以1mLPBS溶解至装入透析袋。对PBS充分透析、除盐换液3次，至萘氏试剂测透析外液为无黄色。将透析袋内样品取少许作适当倍数稀释后，以紫外分光度计测蛋白含量。单克隆抗体的进一步纯化按照ProteinAAgrose说明书进行。SDSPAGE（10％的分离胶和5％的浓缩胶）结合分光光度计检测样品浓度。间接ELISA法检测收集腹水的效价。1.2.7纯化抗CD3单克隆抗体刺激T细胞活化的活性检测采用MTT法。采集肝素抗凝的正常人静脉血,以FicollHypaque密度梯度离心法分离外周血单个核细胞,再以尼龙毛柱法分离纯化T细胞。取100μL(1×109细胞/L),用流式细胞仪分析T细胞的纯度，其余用于刺激T细胞活化的活性分析。96孔板上用羊抗鼠IgG包被（50倍稀释，加50μL/孔）：加入50倍PBS稀释羊抗鼠IgG50μL/孔，4℃过夜。弃上清。加入1％BSA（PBS稀释）100μL，37℃，3h，弃上清用PBS洗2次。4℃保存。RPMI1640培养液稀释纯化的单克隆抗体（设1∶10、1∶100、1∶500三个稀释度），每孔100μL，以培养基为对照组，设3个复孔，向各孔中分别加入100μL的T淋巴细胞悬液（2×104），37℃、5%CO2培养。72h后，取培养板每孔加MTT液20μL，继续培养4h，2500r/min离心10min，弃上清培养液，每孔加Formazan裂解液100μL，待其沉淀溶解，在测定波长570nm，参比波长630nm下测定吸光度。 1.2.8碱性磷酸酶抗碱性磷酸(APAAP)桥联酶标法测定T细胞亚群［5,6］常规法FicollHypaque密度分离法，分离健康人外周血单个核细胞，洗涤后用含10％(φ)FCS的PMI1640调整细胞浓度至1×10６／mL。桥联酶标法操作安装说明书进行：取100μL细胞悬液滴加在干净载玻片上，风干，用纯丙酮固定。PBS洗3次，每次2min,干燥，用蜡笔画圈标记细胞所在位置。加一抗（自制鼠抗人单克隆抗体）10μL，37℃湿盒孵育30min;PBS浸洗5min，擦片。加二抗1∶50羊抗鼠IgG10μL，37℃湿盒孵育30min;PBS浸洗5min，擦片。加碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶(1∶2000)复合物10μL。37℃湿盒孵育30min;PBS浸洗5min，擦片。加碱性磷酸酶底物10μL，37℃湿盒孵育30min;PBS浸洗5min，擦片。Mayer苏木精复染1min，自来水下冲洗,镜检。2结果与分析2.1单克隆抗体的制备应用B淋巴细胞杂交瘤技术，进行4次细胞融合，平均融合率约95%。将所得阳性克隆孔进行有限稀释克隆化4～5次，直到亚克隆的阳性率均达到100%。最后获得1株杂交瘤细胞。经体外连续培养半年及液氮反复冻融多次，分泌抗体水平未见下降。说明已是稳定分泌鼠抗人CD3单克隆抗体的杂交瘤细胞株。2.2单克隆抗体含量测定将杂交瘤细胞的腹水和精制单克隆抗体10μL进行SDSPAGE（如图1），可见重链和轻链的分子量分别为55和25kD的条带。用先盐析后透析，然后再用ProteinAAgrose纯化，单克隆抗体浓度为20mg/mL;所得纯品经10倍逐级稀释，用间接ELISA法检测腹水的效价为1×10-7。2.3抗CD3单克隆抗体刺激T细胞活化的活性分析 以FicollHypaque密度梯度离心法分离PBMC,再通过尼龙毛柱法纯化T细胞，用FITC标记的抗CD3单克隆抗体进行流式细胞术分析。结果表明,T细胞的纯度为86.9%。用纯化的单克隆抗体刺激纯化的T细胞,同时设阳性及阴性对照,作用72h后，加入MTT液继续培养4h，收集细胞,测定吸光度。结果显示与对照组相比,抗CD3单克隆抗体具有明显的T细胞刺激活性。2．4桥联酶标法测定T细胞亚群通过对空白对照和试验组玻片的显微镜镜下观察，计数100个细胞，可计算出阳性细胞率。镜下可见（如图2）阳性细胞细胞膜上或胞质着色为红色，胞核为蓝色（箭头1所示）。阴性细胞细胞膜上或胞质着色为无色，胞核为蓝色（箭头2所示）。统计学分析得出CD3阳性T细胞百分率(n=20，±s)为（73±7）％。3讨论　　自第一个T细胞CD3分子特异性的单克隆抗体OKT3在首届国际白细胞分化抗原会议上得到公认以来，目前许多实验室已生产出众多抗TCR/CD3复合体分子的单克隆抗体，不同的单克隆抗体在亲和力、免疫球蛋白类和亚类及其特异性上不尽相同。　　本研究以基因重组表达CD3为免疫原，加佐剂进行基础免疫后，经融合、筛选及克隆化，得到1株分泌抗CD3单克隆抗体的杂交瘤细胞。取之连续3次克隆化后达100％阳性。用此杂交瘤细胞制备的腹水效价为10-7。该细胞株经体外连续培养半年及液氮反复冻融多次，其分泌单克隆抗体的能力不变,表明上述方法免疫成功。为了获得高纯度的单克隆抗体，采用了盐析和透析相结合的方法。考虑到蛋白质浓度愈高，所需盐的饱和度极限愈低，但杂蛋白的共沉作用也随之增加，从而影响蛋白质的纯化。故将腹水以PBS作等倍稀释后再盐析。离子强度也可影响蛋白质沉淀，当硫酸铵饱和度为33％时γ球蛋白析出。实验还发现蛋白沉淀后宜在4℃过夜，更易于形成较大沉淀而易于分离。抗CD3 单克隆抗体蛋白的检测采用Westernblot法［7］。取抗CD3单克隆抗体进行SDSPAGE，再用BioRad公司的蛋白转印系统，转印至硝酸纤维素膜上,以HRPmMcAbCD3进行检测,经相应试剂盒鉴定本单克隆抗体的重链为小鼠IgG2a亚类，轻链为κ型。T细胞是由一群功能不同的异质性淋巴细胞组成［8］，由于它在胸腺内分化成熟故称为T细胞。成熟T细胞由胸腺迁出，移居于周围淋巴组织中淋巴节的副皮质区和脾白髓小动脉的周围。不同功能成熟的T细胞均属小淋巴细胞，在形态学上不能区分，但可借其细胞膜表面分子不同加以鉴别。故本次制得抗CD3单克隆抗体可作为T淋巴细胞鉴定的物质基础，用于相关试剂盒的研发。结合本次实验结果，还可以用其进一步联合其他单克隆抗体测定CD4和CD8阳性细胞的百分率，以提高检测细胞功能以及分类的准确率。　　此外，本文制备的鼠抗人TCR/CD3单克隆抗体，可为单克隆抗体结合其他技术（如放射免疫分析）提供物质基础，这对受检者健康状态判断、疾病检出、指导诊断和临床治疗均具有一定的实际意义。【参考文献】［1］JASPERTR，GESKET，TEICHMANNA，etal．Laboratoryscaleproductionofmonoclonalantibodiesinatumblingchamber［J］．JImmunolMethods，1995，178：77.［2］SUSANKERHWEOU，PAULHP，TERSONT．Amoreefficientandeconomicalapproachformonclonalantibodyproduction［J］．JImmunolMethods，1997，209：105.［3］PANHui,JIANGHongliang.Afibroblast/macrophagecoculturemodelforinvitroevaluationofmaterialbiocompatibilityandbiodegradability［C］.Bioengineering 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